一种用于黄曲霉毒素b1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黄曲霉毒素 Bl样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于黄曲霉 毒素 Bl富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素 BI (Aflatoxin Bl简写为AFBl)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含 有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。黄曲霉毒素 Bl是已知的化学物质中致癌 性最强的一种。黄曲霉毒素 Bl对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对 肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素 Bl最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定 黄曲霉毒素 Bl是大部分食品的必检项目之一。中国食品卫生标准中规定了几种主要易受 污染的食物中黄曲霉毒素 Bl的允许量标准，玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素 Bl允许量为 < 20 μ g/kg ;其他食用油为< 10 μ g/kg ;其他粮食、豆类、发酵食品为< 5 μ g/kg。
[0003] 目前食品中黄曲霉毒素 BI的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析 法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性 大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物， 从而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有 害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较 高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。
[0004] 免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年来发 展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB)既可结合活性蛋白 质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠 上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力 作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠 (Hffi)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学 和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显 著成绩。近年来以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等 标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。
[0005] 在分离真菌毒素方面，頂B可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避 免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。对目的毒素的富集具有高分离 率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优 点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化 的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团， 从而减少漏检，减少安全隐患。
[0006] 本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集黄曲霉毒素 Bl的免疫磁珠的制备工 艺及应用条件进行了优化，大大提高了对黄曲霉毒素 Bl的富集能力和检测灵敏度，同时凭 借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及饲料中黄曲霉毒素 BI的 分离与富集，可以进一步提高快速检测黄曲霉毒素 Bl的效率。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于黄曲霉毒素 Bl富 集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决黄曲霉毒素 Bl样品净化分离操作复杂、分 离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种用于黄曲霉毒素 Bl富 集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体；所述黄曲霉毒素 Bl 单克隆抗体是用黄曲霉毒素 Bl人工抗原免疫白鼠所得到的；所述黄曲霉毒素 Bl人工抗原 是黄曲霉毒素 Bl半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式I所示：
[0010] 所述黄曲霉毒素 Bl半抗原是按照如下方法制备得到的：
[0011] 62mg黄曲霉毒素 Bl溶于ImL二甲基亚砜（DMS0)，60°C下缓慢滴加入25mg对苯二 胺和0.1 mL吡啶在ImL DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析 纯化后得到黄曲霉毒素 Bl的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素 Bl半抗原，得率90%。
[0012] 所述黄曲霉毒素 Bl人工抗原是按照如下方法制备得到的：
[0013] 取半抗原9. 4mg，用2mL 0. lmol/L HCl溶解，得到溶液A。取亚硝酸钠20mg用ImL 水溶解，逐滴加入到溶液A中。用碘化钾试纸检测，室温搅拌反应30min。取50mg BSA，用 4mL水溶解，得到溶液B。将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜。用0. 02mol/ L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到黄曲霉毒素 BI人工抗原。
[0014] 所述黄曲霉毒素 Bl半抗原的分子结构式如式II所示：
[0015]
[0016] 本发明还提供了一种上述免疫磁珠的制备方法，是以粒径2. 8 μπι的羧基磁珠为 载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂H)C-NHS组合处理后，活化磁 珠可与黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化黄曲霉毒素 Bl的免疫磁 珠；
[0017] 上述免疫磁珠的制备方法具体描述如下：
[0018] (1)清洗：取IOOyL羧基磁珠于离心管中，用IOOyL含0.05%吐温-20的ρΗ5·0、 25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
[0019] (2)活化：用 4°C贮存的 pH5. 0、25mmol/L MES 溶液分别配制 50mmol/L 的 EDC、NHS 溶液；分别加入50 μ L新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混勾，室温活 化30min，磁分离后移除上清，同（I)MES溶液洗涤2-3次；
[0020] (3)偶联：将黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体溶解到60 μ L pH5. 0、25mmol/L MES溶液 中，用所述MES溶液调节总体积至100 μ L，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或 4°C偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
[0021] ⑷封闭：磁分离后移除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的TRIS溶液反应15min封闭磁 珠；
[0022] (5)保存：磁分离后移除上清，用IOOyL含0. 1 %-0.3 %牛血清白蛋白（BSA)、 0. 1 %吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含 0· 1% -0· 5% BSA、0. 01% -0· 1%吐温-20、0· 02% NaN3的 TRIS 溶液中，2-8°C保存备用。
[0023] 本发明同时提供了上述免疫磁珠在富集净化黄曲霉毒素 Bl中的应用。
[0024] 实验证明，本发明用于黄曲霉毒素 Bl富集净化的免疫磁珠对黄曲霉毒素 Bl有很 高的富集率和回收率，对黄曲霉毒素 Bl的富集率为25ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获 25ng黄曲霉毒素 BI)，对黄曲霉毒素 Bl的回收率达到85%以上。本发明用于黄曲霉毒素 B1富集净化的免疫磁珠可以高效、准确、可靠、快速、简便地把待检样品中的黄曲霉毒素 B1 富集起来，以便进一步应用于化学分析仪器检测（HPLC，高效液相色谱法）、酶联免疫吸附 法检测和胶体金测试条的快速测试，具有浓缩待测样品中黄曲霉毒素 Bl浓度、提高检测下 限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。
【附图说明】
[0025] 图1黄曲霉毒素 Bl半抗原合成路线图
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的实验 方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，即为可从商业途 径得到的试剂和材料。
[0027] 实施例1用于黄曲霉毒素 Bl富集净化的免疫磁珠的制备
[0028] 本实施例给出了由黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体和含羧基的免疫磁珠偶联得到的偶 联物作为富集净化黄曲霉毒素 Bl的免疫磁珠的制备方法。该方法包括：
[0029] -、黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体的制备
[0030] 1、黄曲霉毒素 Bl半抗原的合成（合成路线见附图1)及鉴定
[0031] 62mg黄曲霉毒素 Bl溶于ImL二甲基亚砜（DMS0)，60°C下缓慢滴加入25mg对苯二 胺和0.1 mL吡啶在ImL DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析 纯化后得到黄曲霉毒素 Bl的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素 Bl半抗原，得率90%。
[0032] 取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，7. Oppm左右增加的2组芳环信号峰，说明半 抗原合成成功。
[0033] 2、黄曲霉毒素 Bl人工抗原的合成及鉴定
[0034] 取半抗原9. 4mg，用2mL 0. lmol/L HCl溶解，得到溶液A。取亚硝酸钠20mg用ImL 水溶解，逐滴加入到溶液A中。用碘化钾试纸检测，室温搅拌反应30min。取50mg BSA，用 4mL水溶解，得到溶液B。将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜。用0. 02mol/ L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到黄曲霉毒素 BI人工抗原，分装后-20°C保存。
[0035] 按合成黄曲霉毒素 Bl人工抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进 行紫外（200nm~400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其 结合比。偶联物黄曲霉毒素 Bl半抗原-BSA的最大吸收峰与黄曲霉毒素 Bl半抗原、BSA的 最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明黄曲霉毒素 Bl半抗原-BSA的合成是成功的。经 计算，半抗原与BSA的结合比为15:1。
[0036] 3、黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体的制备
[0037] (1)杂交瘤细胞的获得
[0038] 1)首次免疫：将黄曲霉毒素 Bl半抗原-BSA偶联物（免疫原）与等量的弗氏完全 佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0. 2mL ;
[0039] 2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代 替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
[0040] 3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到 1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0. lmL，三天后 处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
[0041] 4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释 法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌黄曲霉毒素 Bl单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细