黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，属于亲和层析和真菌毒素分析领域。采用环氧活化琼脂糖微球FF作为固相载体，与氨基修饰黄曲霉毒素B1适配体偶联后，封闭载体中多余活性位点，填入微型小柱制成。所制备的适配体亲和柱能与黄曲霉毒素B1特异性结合，其加标回收率在70~110之间，至少可以重复使用五次。
【专利说明】黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及亲和层析及真菌毒素检测【技术领域】，具体涉及黄曲霉毒素B1适配体 亲和柱的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素B1均为黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢物，具有致癌、致畸、致突变 的作用，是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素，一般食品加工条件都不易破坏，因此给消费 者的饮食安全埋下了巨大的隐患。各国对食品中黄曲霉毒素残留量现状非常重视，制定了 相应的限量标准，如我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素允许量标准为（Bl + B2 + G1 + G2) 10 ng /g〇
[0003] 目前，黄曲霉毒素B1的分析方法中，常用的有高效液相色谱、毛细管电泳、液质联 用等。这些仪器分析方法对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理，传统的前处理技术有 免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，多为一次性的。建立高选择、快速有效 的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素B1检测分析中需要解决的重要问题。 基于适配体亲和层析是一种新型高效样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分 子选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化处理，这种吸附是可逆的。适配体 的亲和层析结合常规仪器分析已成为真菌毒素分析的一个发展方向，但目前尚未见其适配 体亲和柱的制备方法及其应用报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，所研制的 亲和柱是将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体与环氧活化的琼脂糖6FF偶联填充于固相萃 取柱中，用于纯化含黄曲霉毒素B1的待测样品。
[0005] 本发明的技术方案为：一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其步骤：1 活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时。用60mL 去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；2偶联：将氨基修饰的黄曲霉毒素B1 适配体溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸盐缓冲液中。将步骤1中溶胀凝胶悬浮于含适配 体的缓冲液中，在37°C的水浴中振摇16小时。反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适 配体，静置5min后，移除清洗液；3封闭：将步骤（2)中凝胶悬浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺 溶液中，在50°C的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4.0 乙酸缓冲液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循 环3次；4装柱：将步骤3的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱（内径5. 0 mm，容积1. OmL)，避免 产生气泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
[0006] 其中步骤2中氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体为DNA合成公司商品化生产，黄曲 霉毒素B1 适配体的序列为：5'-ITT ITT GIT GGG CAC GTG ITG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C-NH2-3，。
[0007] 本发明黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的应用方法，按下述步骤进行：a上样：放掉柱 内溶液，将提取的样品用〇. lmol/LpH8.0磷酸盐缓冲液溶解或稀释，上样。上样时流速不超 过lmL/min，避免样品流干。b淋洗：待样品过柱后，用3 mL二次水淋洗柱床、弃去。c洗脱： 用3mL甲醇洗脱，在50°C下氮气吹干，用流动相定容待测。d再生：对于使用之后的凝胶，以 2?3 倍柱体积的含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/ pH4. 5乙酸缓冲液交替冲洗2?3次。
[0008] 本发明的优点在于：本发明制备的适配体亲和柱能够与黄曲霉毒素B1特异性结 合，一次净化能除去绝大部分干扰物。制备的适配体亲和柱最大结合容量约为80 ng黄曲 霉毒素B1。采用的洗脱液为甲醇时，加标回收率在70~110%之间。制备的适配体亲和柱重 复使用5次，回收率不低于70%。
【具体实施方式】
[0009] 本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不能作为本发明的限定内 容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0010] 实施例1黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备： 1活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时。 用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液； 2偶联：将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸盐缓冲 液中。将步骤1中溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37°C的水浴中振摇16小时。反 应完后，再用3mL去离子水洗漆未反应的适配体，静置5min后,移除清洗液； 3封闭：将步骤2中凝胶悬浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液中，在50°C的水浴中振摇 4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0?lmol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/ LNaCl的pH8. 3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次； 4装柱：将步骤3的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱（内径5. 0 mm，容积1. OmL)，避免产 生气泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
[0011] 其中步骤2中氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体为DNA合成公司商品化生产。
[0012] 本发明所述黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的性能评价方法： 实施例1所制备的亲和柱最大结合容量的测定：分别用10mL20. 0ng/mL (200ng)过黄 曲霉毒素B1亲和柱。上样液每毫升收集一管，用HPLC-MS/MS测定每管中黄曲霉毒素B1含 量。根据下式计算：最大结合容量（即被吸附的黄曲霉毒素B1总量）等于上样总量减去洗 下的黄曲霉毒素B1总量。结果发现，l~5mL上样液只测出黄曲霉毒素B1，到5mL开始无吸 附。因此，偶联1.9 nmol/L黄曲霉毒素B1适配体的亲和柱最大结合容量约为80 ng。
[0013] 实施例1所制备的亲和柱加标回收率和重复性测定：分别上样20mL的0. 5ng/mL、 1.0 ng/mL、2. 0ng/mL三种不同浓度的黄曲霉毒素B1，每种浓度作三组平行。收集洗涤液后 用HPLC-MS/MS测定回收率。结果见表1，经测定回收率均达到90%以上，相对标准偏差少于 10%。
[0014] 表1制备的黄曲霉毒素B1亲和柱加标回收率和重复性
【权利要求】
1. 一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其步骤：（1)活化：取60mg的环氧 活化琼脂糖微球FF在2mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时，用60mL去离子水分三次 洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；（2)偶联：将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体溶于 lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸盐缓冲液中，将步骤（1)中溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲 液中，在37°C的水浴中振摇16小时，反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静 置5min后，移除清洗液；（3)封闭：将步骤（2)中凝胶悬浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液 中，在50°C的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4.0乙 酸缓冲液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环 3次；（4)装柱：将步骤（3)的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱，避免产生气泡，用5mL0. lmol/ LpH8. 0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
2. 根据权利要求1所述黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其特征在于：其中步 骤（2)中氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体为DNA合成公司商品化生产，黄曲霉毒素B1适配 体的序列为：5，_ NH2-TIT ITT GIT GGG CAC GTG ITG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C -3，。
3. 根据权利要求1所述黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其特征在于：本发明 黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的应用方法，按下述步骤进行：（a)上样：放掉柱内溶液，将提 取的样品用〇. lmol/LpH8. 0磷酸盐缓冲液溶解或稀释，上样，上样时流速不超过lmL/min， 避免样品流干；（b)淋洗：待样品过柱后，用3 mL去离子水淋洗柱床、弃去；（c)洗脱：用 3mL甲醇洗脱，在50°C下氮气吹干，用流动相定容待测；（d)再生：对于使用之后的凝胶，以 2?3 倍柱体积的含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/ pH4. 5乙酸缓冲液交替冲洗2?3次。
【文档编号】B01D15/38GK104399283SQ201410723990
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】廖且根, 罗林广, 李伟红, 胡丽芳 申请人:江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所