用于制备整料柱的方法
【专利说明】用于制备整料柱的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及制备用于液相色谱的柱，更具体是聚合物整料柱，其特别用于肽和其 它分子的纳米尺度分离。
[0002] 发明背景 蛋白质组学可被定义为蛋白质的大尺度分析，并且有希望在临床研宄中发现未来的生 物标志物。在自底向上的蛋白质组学中，待分析的蛋白质组中的蛋白质被鉴定，并且它们的 氨基酸序列和翻译后修饰通过以下来表征：蛋白水解酶消化，接着通过质谱法（MS)分析得 到的肽。如果蛋白质的数量大，则相应的肽的数量甚至更大，因为当用特异性酶例如胰蛋白 酶切割时，许多蛋白质产生超过10个肽。因此，必须将分离和检测的有力工具应用于成功 的蛋白质组学实验。与电喷质谱连接的液相色谱（LC-MS)或者与串联质谱连接的液相色谱 (LC-MS/MS)提供分离和选择性检测这样的巨大量的肽的解决方案。分子离子在大气压下通 过电喷射离子化（ESI)产生，这被认为是一种浓度灵敏性方法。
[0003] 通过使用具有低内径（ID)的色谱柱可改善灵敏性，因为肽将随后以较低的体积 洗脱，并因此以较高的浓度提供。理论上，该浓度上的相对增加将提供信号上的相应增加。 以该方法，通过使用具有非常低的ID的柱将提供更加灵敏的分析。因此，例如，可显示在理 论上，在肽的液相色谱分离中将柱ID从4. 6缩减至0. 02 mm，得到分离的肽的浓度相对增加 (和由此在电喷质谱法中灵敏度增益的相应增加）约52, 900倍。当今，该类型的缩减在蛋 白质组学工作中非常常见，并且通常通过使用具有0.075 mm ID的柱，流动相的流量被降低 至几百纳升/分钟。
[0004] 如其它研宄者已证实，甚至可能进一步缩减液相色谱，以实现极度灵敏的LC-MS 分析。然而，因为难以用颗粒填充非常狭窄的毛细管，市售可得的填充柱在技术上仍限制在 0.075 mm ID。理论上，与制备整料柱有关的这样的限制和困难不存在。
[0005] 在整料柱中，分离介质为可与不含有颗粒间空隙的单一大"颗粒"相比较的形式， 换句话说，所述分离介质为连续介质。因此，所有流动相必须通过固定相流动。该对流极大 加速了传质速率。与作为在色谱过程期间在颗粒固定相的孔内传质的典型驱动力的扩散相 反，通过孔的对流能够显著增加分离速度。
[0006] 因为连续分离介质提供的相对于填充柱的优点，近些年来连续分离介质的开发已 经吸引了大量的关注。基本上，已经使用了两种类型的整料材料，第一种基于改性的二氧化 硅凝胶，第二种基于有机聚合物。然而，尽管连续二氧化硅凝胶介质在聚合过程期间收缩， 这使其难以制备实际有用的具有小内径的二氧化硅凝胶基整料柱，但当通过合适的有机单 体在具有内径小到〇. 1 _的熔凝二氧化硅毛细管中原位聚合来制备整料柱时，未见这些困 难。
[0007] 聚合混合物可使用多种单体制备，对于保留和分离选择性的变化而言，这允许几 乎不受限制地选择基质和表面化学两者。丙烯酰胺、聚苯乙烯和甲基丙烯酸酯整料柱可被 提及作为频繁使用的实例。通常添加成孔剂（porogen)或成孔溶剂，以控制所得整料的多 孔结构。
[0008] 多种聚合物整料柱，包括狭窄ID毛细管柱，和其制备方法已在现有技术中有所描 述。
[0009] WO 2007/149498 A2公开了分离毛细管柱或在微制装置中的通道，其通过功能单 体和交联单体（其增强聚合物基质的强度）的原位共聚合作用制备。苯乙烯基单体例如苯 乙烯和二乙烯基苯，或者甲基/丙烯酸基单体例如丁基或硬脂基甲基丙烯酸酯和乙二醇二 甲基丙烯酸酯，是优选的。极性成孔溶剂（或成孔剂），例如乙醇、甲醇、丙醇或乙腈用于所 述反应。柱可以稳健的方式制备为具有极狭窄的ID，例如5-15 Mm，使得它们适合用于超痕 量LC/MS蛋白质组学分析。
[0010] WO 2004/064974 A2公开了制备用于毛细管柱或者在微制装置（微芯片）中的通 道的超-纳米尺度-LC整料分离介质的方法，和通过所述方法制备的毛细管。在整料聚合 过程期间向毛细管的两端施加适度的正压，允许制备具有极低ID例如25 Mm和更小的整料 毛细管柱，具有提高的传质性质和低的背压，以及优秀的保留时间的柱间再现性。在优选的 实施方案中，苯乙烯被选为单体、四氢呋喃（THF)和正-辛醇被选为惰性成孔剂，以及二乙 烯基苯（DVB)作为交联剂。偶氮二异丁腈（AIBN)作为自由基引发剂。其它合适的可交联 单体包括甲基丙烯酸酯。
[0011] US 7, 473, 367 B2公开了制备整料色谱柱的方法，即通过添加含有成孔剂的聚合 混合物至容器，并且使聚合混合物在所述容器中聚合以形成呈色谱柱形状的整料色谱聚合 物塞，至少一部分聚合通过以下实现：施用足够的压力至聚合混合物以防止在聚合的整料 聚合物塞中壁通道开口，并且同时以受控的升高温度加热聚合混合物。示例性反相介质基 于共聚（苯乙烯-二乙烯基苯）、共聚（硬脂基甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯）或共聚（丁基 甲基丙烯酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）。
[0012] 类似的整料柱和其制备方法公开于WO 2006/017620 A2、US 2010/0038298 AUWO 00/15778 AU EP 2335820 AU US 2011/0086409 Al 和 WO 00/46281 A2。
[0013] 然而，非常少的整料产品是市售可得的，并且通常这些的ID为0.1 mm和更高。狭 窄ID整料柱的制备是困难的，这是因为聚合过程和毛细管的预涂布似乎依赖于毛细管的 ID。因此，在小瓶中和甚至在0.1 mm毛细管中似乎完美起作用的解决方案可能在0.05 _ ID和更低的毛细管中根本不起作用。
[0014] 本发明的一个目的是提供制备改进的整料柱的方法，所述整料柱可具有低于0. 05 _的ID，并且其可方便地用于肽和其它分子的灵敏性分离。其它目的和优点将从以下描述 中显而易见。
[0015] 发明简述 上述目的通过本发明的方法实现，所述方法产生柱或在微制装置中的通道，其优选 (但不排除）具有狭窄的内径，内部有均匀的整料结构，并且其可用于生物学以及非生物学 化合物的灵敏性分离。
[0016] 根据本发明，这通过小心优化整个聚合程序来实现。
[0017] 更具体而言，本发明经设计用于制备整料柱（或通道），其ID优选可低于0.05 mm， 并且其基于选择性使用（i)单体即二乙烯基苯（DVB)和丙烯酸异癸酯（IDA)的特定组合； 和（ii)特定的成大孔剂或成大孔剂混合物，即异丁醇或异丁醇/辛醇混合物。
[0018] 在一方面，本发明由此涉及制备分离柱或在微制装置中的通道的方法，包括以下 步骤：提供未填充的柱或在微制装置中的未填充的通道；用活化剂活化柱或通道的内壁； 用包含单体、至少一种成孔剂和至少一种聚合引发剂的混合物的聚合溶液填充柱；和将混 合物聚合以形成在柱或通道中的硬质和多孔的整料聚合物。所述方法的特征在于所述单体 包含作为主要单体的二乙烯基苯和丙烯酸异癸酯的混合物，并且所述至少一种成孔剂包含 异丁醇。
[0019] 通常，在柱或通道内形成的硬质整料聚合物塞经洗涤以除去任何残留的未反应成 分。
[0020] 本文所用的术语"分离"以广泛的意义解释，并且包括分析型和制备型色谱分离以 及固相提取（SPE)，包括固相微提取（SPME)。典型的色谱应用包括分析型液相色谱（LC)、制 备型IX、纳米-LC、HPLC。
[0021] 柱或通道的材料可选自各种不同的材料。典型的柱材料包括玻璃（包括熔凝的二 氧化硅）、金属例如不锈钢、塑料（例如聚醚醚酮-PEEK)、玻璃衬里（例如硅酸硼衬里）或 熔凝的二氧化硅衬里的不锈钢或塑料管。
[0022] 用于微制装置（例如芯片实验室（LOC)装置）的典型材料包括玻璃、陶瓷、金属和 有机聚合物，例如聚烯烃、聚酰亚胺、PDMS (聚二甲基硅氧烷）。
[0023] 在所述方法的（当前）优选的实施方案中，柱或在微制装置中的通道的内径（ID) 为约0.05 mm或更小。这样的毛细管柱优选由熔凝的二氧化硅制成。
[0024] 用于活化或预官能化未填充柱或通道的内壁表面以锚定或结合聚合物整料至内 壁表面的合适的试剂和方法将根据柱或通道表面材料的材料而选择，并且在各种具体情况 或情景中可由技术人员来选择。一般而言，活化包括共价结合分子或基团至表面，其可在聚 合时进一步结合至聚合物网络。
[0025] 例如，玻璃和金属（例如不锈钢）表面可优选通过用能够结合至聚合物整料的硅 烷化试剂硅烷化而预官能化。示例性的硅烷化试剂包括γ-(三甲氧基-甲硅烷基）丙基 甲基丙烯酸酯（YMAPS)，例如1-20 % (v/v)。YMAPS是包含可聚合的双键的硅烷化试剂， 其允许锚定至聚合物。
[0026] 表面的活化之前优选通过用蚀刻剂蚀刻以简化或改