一种检测玉米赤霉烯酮的试纸板的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胶体金检测试剂板，具体是一种检测玉米赤霉烯酮的试纸板。
【背景技术】
[0002]玉米赤霉烯酮ZEN又称F-2毒素，首先从有赤霉病的玉米中分离得到，其产毒菌是镰刀菌属的菌侏，主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌也能产生这种毒素。玉米赤霉烯酮有多种衍生物，如7-脱氢玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酸等。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，在食品或饲料加工过程中均不易破坏，主要污染玉米、小麦、大麦等粮谷类作物。
[0003]ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。Toshitsugu对19个国家和地区的谷物、食品及饲料中所含的ZEN进行了调查发现，包括中国、阿根廷、加拿大、波兰及也门等众多国家和地区的样品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN对动物及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。Schoental R在进行致癌试验时发现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿瘤；此外，试验组和对照组大鼠还发生了乳腺纤维瘤、腺瘤、腺癌、垂体腺癌、睾丸间质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况发生，这些肿瘤所涉及的器官表明，它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此认为，它们是由污染饲料的ZEN或其代谢产物引起的。
[0004]目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉稀酮的含量不能超过0.05mg/kg ;意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉稀酮的含量不能超过0.lmg/kg ;而在法国，植物油和谷类当中玉米赤霉稀酮的含量必须低于0.2mg/kg。中国则规定小麦、玉米中的玉米赤霉稀酮含量不得超过0.06mg/kgo
[0005]目前，对动物玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗，为了控制ZEN对人和动物产生的危害，必须对饲料、谷物等中玉米赤霉烯酮含量进行检测，确定是否含有玉米赤霉烯酮。目前，比较常用的ZEN检测方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法-质谱法(GC-MS)、生物检测法和免疫学检测法等。薄层色谱分析法是较早用于毒素检测的一种方法，操作人员无需经过专门培训，且成本低，无需价格昂贵的仪器。但此方法所需试剂繁多，检测周期长，灵敏度不高等，已远不能满足现代检测要求。高效液相色谱法、气相色谱法-质谱法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，且气相色谱法-质谱法可同时检测不同的镰刀菌毒素，适合于饲料中ZEN的定量分析。但设备昂贵、对样品中毒素纯度的要求较高，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的需要，所以使用受到限制。微生物检测法虽然待检样品不需很纯，但方法专一性差，灵敏度低，主要用于定性，一般只作为化学分析法的佐证。
[0006]ELISA法是免疫学检测方法之一，具有特异、快速、灵敏度高和成本低的特点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查。但此方法需接触ZEN标准品，不利于保护操作者的健康，且酶的活性易受温度影响，因此试剂需要低温保藏、寿命短，并易造成测定结果重复性较差。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简单的检测玉米赤霉烯酮的试纸板，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0008]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种检测玉米赤霉烯酮的试纸板，包括底板、背衬和盖板，所述背衬上依次紧密粘贴的样品吸收垫、胶体金结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品吸收垫、胶体金结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的相邻各部分间有1-2 mm的重叠，所述胶体金结合物释放垫包被胶体金标记的抗体，所述硝酸纤维素膜上具有检测线和质控线。
[0009]作为本发明进一步的方案:所述底板、背衬和盖板由上而下依次压制为一体。
[0010]作为本发明进一步的方案:所述胶体金标记的抗体为玉米赤霉稀酮单克隆抗体。
[0011]作为本发明进一步的方案:所述检测线包被玉米赤霉稀酮-BSA特异性结合抗原，所述质控线包被羊抗鼠多克隆抗体。
[0012]作为本发明进一步的方案:所述胶体金结合物释放垫的1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0013]作为本发明再进一步的方案:所述检测玉米赤霉烯酮的试纸板的制备方法，具体步骤如下:
1)制备喷涂有胶体金标记的抗体的结合物释放垫；
2)制备具有包被有玉米赤霉烯酮-BSA特异性结合抗原的检测线和包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜；
3)将制备好的胶体金结合物释放垫、硝酸纤维素膜与样品吸收垫、吸水垫、底板和盖板组装成试纸板。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明的试纸板具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，操作简单、快速、安全，将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，成本低，易推广，生产成本低廉，投资少，收效快。
【附图说明】
[0015]图1为本发明的结构示意图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0017]请参阅图1，一种检测玉米赤霉烯酮的试纸板，包括底板、背衬5和盖板，所述背衬5上依次紧密粘贴的样品吸收垫1、胶体金结合物释放垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，所述样品吸收垫1、胶体金结合物释放垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4的相邻各部分间有1-2mm的重叠，所述胶体金结合物释放垫2包被胶体金标记的抗体，所述硝酸纤维素膜3上具有检测线6和质控线7，所述底板、背衬5和盖板由上而下依次压制为一体，所述胶体金标记的抗体为玉米赤霉稀酮单克隆抗体，所述检测线6包被玉米赤霉稀酮-BSA特异性结合抗原，所述质控线7包被羊抗鼠多克隆抗体，所述胶体金结合物释放垫2的1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫1下。
[0018]所述检测玉米赤霉烯酮的试纸板的制备方法，具体步骤如下:
1)制备喷涂有胶体金标记的抗体的结合物释放垫2；
2)制备具有包被有玉米赤霉烯酮-BSA特异性结合抗原的检测线6和包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线7的硝酸纤维素膜3 ；
3)将制备好的胶体金结合物释放垫2、硝酸纤维素膜3与样品吸收垫1、吸水垫4、底板和盖板组装成试纸板。
[0019]分解具体步骤如下:
玉米赤霉稀酮半抗原的制备:
取玉米赤酶稀酮40mg，1,3-丙二胺0.12mL及少量4- 二甲氨基卩比啶加入5mL干燥的二甲基甲酰胺中，作为A液；取N，N’ - 二环己基碳二亚胺50mg溶解于1.5mL干燥的二甲基甲酰胺，作为B液；0°C条件下缓慢滴加B液于A液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应24小时。蒸除溶剂，柱层析纯化后得到羧丙基玉米赤酶烯酮。
[0020]免疫原的制备:
取8mg半抗原，溶解于1.2mL 二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液0.3mL，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取牛血清白蛋白(BSA) 38mg，使之充分溶解在2.7mL0.lmol/L CB (pH9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24h，用5M的硼氢化钠水溶液0.2mL进行还原反应4小时，用0.01mol/L PBS4°C透析3d，每天换透析液3次，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。
[0021]包被原的制备:
取6mg半抗原，溶解于lmL 二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液0.15mL，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取卵清蛋白(OVA) 32mg，使之充分溶解在2.7mL0.lmol/L CB (pH9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到0VA溶液中，并于室温下搅拌24h，用5M的硼氢化钠水溶液0.4mL进行还原反应5小时，用0.01mol/L PBS4°C透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物