一种检测玉米赤霉烯酮的试纸条及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测玉米赤霉烯酮的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测玉 米赤霉烯酮的胶体金试纸条，特别是用于谷物中玉米赤霉烯酮残留的检测。
【背景技术】
[0002] 玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷 镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。1962年Stob等首先从发霉的玉米中分离得到了 该毒素，命名为玉米赤霉烯酮；1966年Urry首次阐明了该毒素的结构，并将此结构命名 为F-2毒素，后又被改称为ZEN。ZEN为白色晶体，分子式C18H2205,化学名为6-(10_羟 基-6 氧基-1-碳烯基）0 -雷琐酸-U-内酯[6-(l0-hydroxy-6-0X0-trans-l_undeceny )旦-resorcylicacidlactone]，溶点 164 ~165，°C紫外线光谱最大吸收为 236nm、274nm 和316nm。红外线光谱最大吸收为970nm，其甲醇溶液在254nm短紫外光照射下呈明亮的 绿-蓝色荧光。ZEN不溶于水，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、甲醇及乙醇等。 在植物体内，ZEN主要代谢产生a-玉米赤霉烯醇（a-Zearalenol，a-ZOL)。在动物及人 体内，除了可以代谢产生a_Z0L外，ZEN还可代谢产生玉米赤霉烯醇（0-zearalenol， 3-Z0L)，a-Z0L和P-Z0L又可以相互转化并进一步代谢产生a-玉米赤霉醇（zeran〇l， a-zearalanol，ZAL)及 0 -玉米赤霉醇（Taleranol, 0 -Zearalanol，TAL)，而ZAL、TAL以 及玉米赤霉醇（zearalanone，ZAN)又可相互转化。
[0003]ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。Toshitsugu对19个 国家和地区的谷物、食品及饲料中所含的ZEN进行了调查发现，包括中国、阿根廷、加拿大、 波兰及也门等众多国家和地区的样品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制品 等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN对动物 及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物 后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统， 免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。SchoentalR在进行致癌试验时发 现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿瘤；此外，试验组和对照组大鼠还发生了乳腺 纤维瘤、腺瘤、腺癌、垂体腺癌、睾丸间质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类 似情况发生，这些肿瘤所涉及的器官表明，它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此 认为，它们是由污染饲料的ZEN或其代谢产物引起的。
[0004]目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。 例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0. 05mg/kg;意大利规定在谷物和 谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过〇.lmg/kg;而在法国，植物油和谷类当中玉米赤 霉烯酮的含量必须低于〇. 2mg/kg。中国则规定小麦、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超过 0.06mg/kg〇
[0005] 玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法（TLC)、酶联吸附免疫法（ELISA) 和高效液相色谱法（HPLC)。TLC法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机 溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。而ELISA法测定结果受试剂盒差异、 实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大，重复性差，假阳性率高，难以达到相关技术要求。常 规的HPLC法虽然比TLC灵敏度高。但由于样品前处理手续繁琐，操作复杂，也难以推广。以 上几种方法均耗时较长，而随着商品经济的发展，人们对时间概念的加强，无论是商家还是 政府部门对检测时间的要求越来越高，而胶体金试纸条作为一种快速检测技术，能很好的 解决这个问题，提高检测效率，缩减检测时间。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的玉米赤霉烯 酮残留检测试纸条。
[0007] 本发明所提供的检测玉米赤霉烯酮残留的试纸条，包括样品吸收垫（1)、结合物释 放垫（2)、反应膜（3)、吸水垫（4)和底板（7);所述反应膜上具有包被有玉米赤霉烯酮半抗 原-载体蛋白偶联物的检测线（5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6)，所述结合物释放垫 (2)喷涂有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物。
[0008] 所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联物是由玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋 白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白 蛋白。
[0009] 所述抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体是以玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联物作 为免疫原制备获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。
[0010] 所述样品吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反应膜（3)、吸水垫（4)依次粘贴在底板 (7)上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0011] 所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或 滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可 为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
[0013] 1)制备喷涂有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0014] 2)制备具有包被有玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊 抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0015] 3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成 试纸条。
[0016] 具体地说，步骤包括：
[0017] 1)半抗原制备：将玉米赤霉烯酮与1，3-丙二胺反应得到玉米赤霉烯酮半抗原；
[0018] 2)将玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联，得到玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白 偶联物；
[0019] 3)用玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细 胞通过融合、筛选，得到可分泌抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0020] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0021] 5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0022] 6)将步骤3)制备的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得 到抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物；
[0023] 7)将抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37°C烘 lh后取出，置于干燥环境中保存备用；
[0024] 8)将玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗 鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；
[0025] 9)将样品吸收垫用含0. 5%牛血清白蛋白（体积分数)、pH为7. 2、0.lmol/L磷酸盐 缓冲液浸泡2h，37°C下烘干2h;
[0026] 10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收 垫盖住结合物释放垫，最后切成3_宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30°C条件下可保存 12个月。
[0027] 本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测谷物中玉米赤霉烯酮残留 的方法，它包括步骤：
[0028] (1)样品前处理；
[0029] (2)用试纸条进行检测；
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