专利名称：一种玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品、谷物和饲料中玉米赤霉烯酮污染的检测技术，具体涉及一种玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条及其制备方法和用途。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(Zenralenone, ZEN)是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素，污染范围广泛，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节，都有可能受到ZEN的污染。ZEN具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽、反刍动物均影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，并且ZEN对高温稳定，不易去除，严重危害人类健康。目前大多数国家对食品、谷物、饲料中ZEN 含量进行了严格限定。目前比较常用的检测ZEN方法有薄层色谱法(TLC)、液相色谱法(LC)、气相色谱法-质谱法(GC-MS)、生物检测法和免疫学检测法等。以免疫化学为基础的ELISA方法可用于大批样品的筛选，阳性结果可用HPLC法等进一步确证，避免直接使用仪器导致成本较高的缺点，可以节省时间和费用，另外由于ELISA法成本较低，而且具有准确、快速、特异性好、灵敏度高等优点特别适合于基层机构大面积筛选样品之需，具有广泛的应用前景。由于ZEN为半抗原，需通过竞争ELISA法检测，相应的检测人员需经过此方面培训才能获得较正确结果。而免疫荧光快速检测试纸条检测，检测者无需培训，操作简单，短时间可获得结果(10分钟左右);若与荧光定量检测仪(读卡器)连用，可实现定量检测，因此具有良好的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、携带方便且制备成本低，可快速检测玉米赤霉烯酮污染的玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条。本发明的另一个目的是提供上述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条的制备方法。本发明的另一个目的是提供上述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条的检测方法。本发明的另一个目的是提供上述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条在检测食品、谷物、饲料中玉米赤霉烯酮污染的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
一种玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条，该检测试纸条由样品垫、荧光微球探针结合垫、醋酸纤维素膜、吸水纸和塑料底板组成；所述塑料底板上依次粘贴样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述荧光微球探针结合垫上包被了 ZEN单克隆抗体的荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上依次包被有羊抗鼠IgG抗体和ZEN的完全抗原ZEN-BSA,以羊抗鼠IgG抗体为质控线，以完全抗原ZEN-BSA为测试线。上述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤
(1)制备ZEN的单抗(Abl-1G4，分泌Abl-1G4的杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCCNO C201237)；
(2)通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成抗体(抗ZEN单抗)的荧光标记；
(3)将步骤(2)制备所得抗ZEN单抗的荧光微球探针包被在结合垫上，将羊抗鼠IgG抗体和ZEN的完全抗原ZEN-BSA分别包被在硝酸纤维素膜上，羊抗鼠IgG抗体作为质控线，ZEN的完全抗原ZEN-BSA作为测试线； (4)将样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸由一端依次粘贴在塑料底板上，即得到所需玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条。上述步骤(I)中，抗ZEN的单抗是采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN单克隆抗体；分泌ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:C201237。上述步骤(2)中，采用EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应进行抗体的荧光微球探针标记，其操作步骤采用常规操作即可实现本发明。上述步骤(3)中，把标记好ZEN单抗的荧光微球探针溶液喷在已处理好的结合垫上，37°C抽风烘干，时间为12 24h ;标记好ZEN单抗的荧光微球探针溶液可按照1 4μ 1/cm的喷量喷在已处理好的结合垫上，优选2 μ 1/cm的喷量。上述步骤(3)中，在硝酸纤维素膜(NC膜)上喷C，T线，C线为质控线，包被羊抗鼠IgG，羊抗鼠IgG的浓度为O. 8^1. 2mg/ml，优选lmg/ml、喷量为I μ 1/cm ;T线为检测线，包被ZEN的完全抗原ZEN-BSA，浓度为I. 2^1. 8mg/ml，优选I. 5mg/ml、喷量为I μ 1/cm ;将喷好C、T线的NC膜在37°C抽风烘干，时间为6 12h。上述步骤(4)中，将样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸由一端依次粘贴在塑料底板上，切割机切割成条，放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。上述ZEN免疫荧光快速检测试纸条的检测方法，是根据待测样品中的ZEN与NC膜T线上的ZEN完全抗原ZEN-BSA竞争结合荧光微球标记的ZEN单抗，通过T线显色的深浅来对待测样品中的ZEN进行分析，其具体包括如下步骤
(I)待测样品处理将食品、谷物和饲料等样品经粉碎后使其90%通过20目网筛。称取5g加到IOOmL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液(v:v，70:30)。震荡器提取IOmin,提取液通过快速滤纸过滤。取ImL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。(2)将上述待测上样溶液滴加于本发明ZEN免疫荧光快速检测试纸条的样品垫上，加样后开始计时；
(3)加样5 10min后，观察T线和C线颜色的不同，从而判断得出待测样品中是否含有玉米赤霉烯酮。
上述步骤(I)中，所述待测样品可以为系列浓度的ZEN标准液；也可以为需要检测的食品、谷物和饲料，但是需要对食品、谷物和饲料等进行样品前处理，采用本领域的常规操作即可，进行后续检测的时候，只需要取样品的试样液进行加样即可。上述步骤(3)中，读取时间选择加样后的5 10min，其余时间读取无效。上述步骤(3)中，当滴入待测上样溶液于样品垫时，由于毛细作用，液体向前移动，到达T线时，样品中的ZEN与固定在T线上的ZEN-BSA复合物竞争结合抗ZEN单抗-荧光微球复合物，若样品中的ZEN浓度小于62. 5ng/ml，则荧光微球探针结合垫中的抗ZEN单抗-荧光微球复合物与T线上ZEN-BSA及C线上羊抗鼠IgG大量结合，T线显色与C线相近，结果为阴性；若样品中ZEN的浓度大于100 ng/ml，则抗ZEN单抗-荧光微球复合物大部分与检测样品中的ZEN结合，很少与T线上的ZEN-BSA结合，因此T线将比C线浅或完全看不到线，而且样品中ZEN浓度越高，T线显色越浅，结果为阳性。
上述检测方法如检测正确进行的话，质控线总会显示绿色荧光线条。 本发明的ZEN免疫荧光快速检测试纸条可用于检测食品、谷物和饲料中是否含有ZEN的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明的试纸制备方法简单、使用方便、经济快捷、成本低廉；
2.玉米赤霉烯酮的检测方法主要是薄层色谱法(TLC法)、高效薄层色谱法(HPTLC)、竞争ELISA法等。TLC法所需试剂繁多，检测周期长，测定时用目测半定量，主观影响较大，且此方法需大量接触ZEN标准品，浪费毒素，又不利于保护操作者的健康，不适用于检测大批样品的实际需要；HPLC法需专业人员操作，所需仪器设备昂贵，也不适于大批样品的筛选；竞争ELISA法检测，相应的检测人员需经过此方面培训才能获得较正确结果。而免疫荧光快速检测试纸条检测，检测者无需培训，操作简单，短时间可获得结果(10分钟左右)；若与荧光定量检测仪(读卡器)连用，可实现定量检测，因此具有良好的市场前
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保藏信息
杂交瘤细胞1G4G10D3，保藏日期2012年4月5日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO :C201237。
图I.试纸加样示意图。图2.试纸阴性结果示意图。图3.试纸阳性结果示意图。图4.试纸无效结果示意图。
具体实施例方式实施例I制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体
I.采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原(ZEN-OVA)，ZEN与BSA偶联制备检测抗原(ZEN-BSA)，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，制备ZEN单抗。
取3只6 8周龄健康BALB/c小鼠(购自南方医科大学动物所)，分别编号，每只小鼠每次免疫剂量为100 Pg，免疫原ZEN-OVA与等体积弗氏完全佐剂(初免)或者不完全佐齐U(加强)乳化(O. 2 mL)，背部皮下多点注射，免疫周期为14 d，每次加强免疫后7 d，断尾取血，获得血清，保存于-20 °C备用。ZEN-BSA作为包被原，间接ELISA测定抗血清效价，间接竞争ELISA测定抗血清的灵敏度。经3次加强免疫，检测结果(如图I)表明I号小鼠的灵敏度最高，IC50值为39. 8ng/mL，选择I号小鼠脾脏作为脾细胞供体，细胞融合前3 d腹腔注射100 μg ZEN-OVACO. ImL)，3 d后取小鼠脾细胞(3. 75 X 108)，在50% PEG 4000作用下与骨髓瘤细胞SP2/0 (购买自中国典型培养物保藏中心)(3. 75 X IO7)进行融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，经过三次克隆化，获得I株稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞，命名为1G4G10D3，其分泌的抗ZEN单抗命名为单抗1G4G10D3。通过小鼠体内诱生法制备腹水型单克隆抗体，具体参见文献(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用，安徽科学技术出版社，1994年11月)。HAT选择培养基含有次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺U密 啶脱氧核苷；HT选择培养基含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷。实施例2制备抗ZEN单抗-荧光微球探针
荧光微球的羧基化将100 μ I荧光微球溶于400 μ I三蒸水中，再分别加入100 μ IlOOmg/mlEDC 和 60mg/ml NHS,室温孵育 30min。反应液 4°C、9000rpm/min,离心 2min,弃去上清，重复此步骤3次，去除多余的EDC和NHS。沉淀用500 μ I ΡΗ7. 2 PBS重悬，超声3min。抗ZEN单抗-荧光微球探针的制备将500 μ I已羧基化的荧光微球溶液与100 μ I溶于三蒸水的抗ZEN单抗(45 μ g/ml)混合，室温反应2h。然后加入2 μ I 10% BSA来封闭微球的剩余羧基，孵育lh。4°C、9000rpm/min离心2min,弃去未结合的抗体。用200 μ I含1% BSA,2% Tween-20 和 20% 海藻糖的 IOmM PH7. 2 PBS 重悬，4°C保存备用。实施例3抗原和抗体的包被
使用自动喷膜仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上喷C，T线，C线为质控线，包被羊抗鼠IgG,羊抗鼠IgG的浓度为O. 8^1. 2mg/ml，优选lmg/ml、喷量为I μ 1/cm ；T线为检测线，包被ZEN的完全抗原ZEN-BSA，浓度为I. 2^1. 8mg/ml，优选I. 5mg/ml、喷量为I μ 1/cm ;C、T线间距为5mm。将喷好C、T线的NC膜在37°C抽风烘干，时间为6 12h。实施例4 ZEN免疫荧光快速检测试纸条的组装
样品垫的处理:玻璃纤维用含2% Tween20、2%(w/v)PVP和2%(w/v)PEG的IOmmoI/LPH7. 2 PBS饱和，37 °C抽风烘干，室温、干燥条件保存备用。突光微球探针结合垫的制备聚酯纤维用O. 1% Tween-20处理lOmin, 60°C抽风烘干，将上述制备的抗ZEN单抗-荧光微球探针按2 ul/cm喷于结合垫上，37°C抽风烘干，室温、干燥条件保存备用。ZEN免疫荧光快速检测试纸条的组装将样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸由一端依次粘贴在塑料底板上，样品垫与结合垫、结合垫与硝酸纤维素膜的间距为2_，切割机切割成条，放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。实施例5 ZEN的检测
将待测上样溶液滴加于本发明ZEN免疫荧光快速检测试纸条的样品垫上，加样后开始计时；加样5 10min后，观察T线和C线颜色的不同，从而判断得出待测样品中是否含有玉米赤霉烯酮。若样品中的ZEN浓度小于62. 5ng/ml，则T线显色与C线相近，结果为阴性；若样品中ZEN的浓度大于62. 5 ng/ml，则T线比C线浅或完全看不到线，即样品 中ZEN浓度越高，T线显色越浅，结果为阳性。若将本发明ZEN免疫荧光快速检测试纸条与荧光定量检测仪(读卡器)连用，可实现定量检测，并且可进一步提高检测的灵敏度
实施例6食品、谷物和饲料样品前处理
食品、谷物和饲料经粉碎后使其90%通过20目网筛。称取5g加到IOOmL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液(v:v，70:30)。震荡器提取lOmin，提取液通过快速滤纸过滤。取ImL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。
权利要求
1.一种玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条，其特征在于该检测试纸条由样品垫、荧光微球探针结合垫、醋酸纤维素膜、吸水纸和塑料底板组成；所述塑料底板上依次粘贴样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述荧光微球探针结合垫上包被了ZEN单克隆抗体的荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上依次包被有羊抗鼠IgG抗体和ZEN的完全抗原ZEN-BSA，以羊抗鼠IgG抗体为质控线，以完全抗原ZEN-BSA为测试线。
2.权利要求I所述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)制备ZEN的单抗Abl-1G4； (2)通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成抗体的荧光标记； (3)将步骤(2)制备所得抗ZEN单抗的荧光微球探针包被在结合垫上，将羊抗鼠IgG抗体和ZEN的完全抗原ZEN-BSA分别包被在硝酸纤维素膜上，羊抗鼠IgG抗体作为质控线，ZEN的完全抗原ZEN-BSA作为测试线； (4)将样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸由一端依次粘贴在塑料底板上，即得到所需镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条； (5)将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸由一端依次粘贴在塑料底板上，即得到所需ZEN免疫荧光快速检测试纸条； 其中，步骤(I)中分泌Abl-1G4的杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO C201237。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(I)中，每ml的荧光微球探针标记30 50ug的抗ZEN单抗。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，把标记好荧光微球探针的ZEN单抗溶液按1 4μ Ι/cm的喷量喷在已处理好的结合垫上，37°C抽风烘干，时间为12 24h。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，羊抗鼠IgG抗体的浓度为O. 8 I. 2mg/ml, ZEN的完全抗原ZEN-BSA的浓度为I. 2 I. 8mg/ml。
6.权利要求I所述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条的检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)待测样品处理食品、谷物和饲料经粉碎后使其90%通过20目网筛； 称取5g加到IOOmL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液(v:v，70:30); 震荡器提取lOmin，提取液通过快速滤纸过滤； 取ImL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液； (2)将上述待测上样溶液滴加于权利要求I所述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条的样品垫上,加样后开始计时； (3)加样5-10min后，观察T线和C线颜色的不同，从而判断得出待测样品中是否含有玉米赤霉烯酮。
7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于所述步骤(I)中的待测样品为系列浓度的ZEN标准液，食品、谷物或饲料提取液。
8.权利要求I所述玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条在检测食品、谷物或饲料中是否含有玉米赤霉烯酮的应用。
全文摘要
本发明公开了一种玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条及其制备方法和应用。本发明所述试纸条是由样品垫、荧光微球探针结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和塑料底板组成。本发明基于抗原抗体的免疫学原理检测食品、谷物和饲料等的玉米赤霉烯酮污染。本研究提供的玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条可以用于玉米赤霉烯酮的现场快速检测，只需5-10min；若与荧光定量检测仪(读卡器)连用，可实现定量检测；操作者不需要专业培训；因此将具有良好的市场前景。
文档编号G01N33/558GK102841204SQ20121030732
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者王宏, 唐勇 申请人:暨南大学