专利名称：一种检测玉米赤霉烯酮的elisa测试盒及制备及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体为玉米赤霉烯酮的酶联免疫分析用测试盒 及制备及检测方法。
(二)
背景技术：
玉米赤霉烯酮(ZEN)可以由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、粉红色镰刀菌、 串珠镰刀菌、三线镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌等多种镰刀 菌产生。在自然状态下这些镰刀菌主要侵染玉米，导致玉米的病毒和带毒。特 别是当玉米收获季节遇到阴雨天时更易遭到感染。除玉米外，小麦、大麦、燕 麦也可感染这些镰刀菌而带毒。ZEN是一种类雌性激素毒素，动物摄食后会产 生雌性激素亢进毒素性反应，玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用， 可引起动物发生雌激素中毒症，主要症状有阴道和乳腺肿胀、子宫肿大、外翻、 导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来经 济损失；玉米赤霉烯酮可直接通过污染的谷类等作物进入人和动物体内，也可 通过被污染的肉、奶等动物性食品进入人体，其引起人中毒的症状主要表现为 无力、头痛、头晕、呕吐、腹泻和中枢神经系统的紊乱。
我国修订的《粮食卫生标准》规定小麦、玉米中ZEN的限量为60pg/kg。 欧盟委员会规则856/2005号规定谷物食品和谷物中玉米赤霉烯酮的最大限量为 20 100pg/kg，于2006年7月1日生效。目前也有许多国家制定了玉米赤霉烯 酮的限量标准，奧地利规定小麦、裸麦、硬质小麦中不得超过60iig/kg，巴西、 法国、罗马尼亚、俄罗斯、乌拉圭等国也制定了相应的限量标准。因此，为了 保障人们的身体健康，必须要对食品中的ZEN进行监控。目前，ZEN的理化分 析技术主要有薄层色谱法、气液相色谱法、质谱和核磁共振等多种方法，由于 以上诸分析方法的样品前处理比较复杂、操作时需专门的技术人员、检测费用 昂贵，不利于推广应用。
(三) 发明内容针对上述问题，本发明提供了一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其 检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯 度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样 品的检测，为此本发明还提供了测试盒的制备及检测方法。
一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色 液B和终止液，其特征在于其还包括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤 霉烯酮单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其特征在于其包括以下 步骤，包被板的制备、玉米赤霉烯酮标准品的制备、玉米赤霉烯酮单抗冻干品 的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。
其进一步特征在于所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔 微孔板，用10 mmol / L 100mmol / L pH9~10 Na2C03-NaHC03的缓冲液作 为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)稀释至0.1^ig/mL 1.0^ig/mL， 96或 48或24孔微孔板各孔加100^1， 2'C 8'C放置过夜，弃去包被液，洗涤2次 5 次，按加入含1% 5%牛血清白蛋白，pH 7 8的磷酸盐缓冲液，2'C 8。C封闭过 夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-2(TC -4(TC冷冻保存；
所述玉米赤霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液为去离 子水，ZEN^农度为0.001 ng/mL 50 ng/mL;
玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)偶联物的制备将ZEN溶解在 3mL 100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加 入10ml 100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5 9.5左右，再用二氯甲烷提 取3次 5次，每次10ml 20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5 3.5 左右，再用二氯甲烷提取3次 6次，每次10ml 20ml，收集二氯甲烷，过无水 硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间产物， 加入3 ml 50ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C 12°C下搅拌反应30分钟 45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml 50ml 蒸馏水和5ml 50ml 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8 9， 5°C~12°C下 搅拌反应5小时 6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次 5次，冷冻干 燥，偶联物-2(TC -4(rC保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐=(10 1000)mg : (10~2000)mg ， ZEN中间产物氯甲酸乙丁酯BSA = (10 1000)mg(10~1000)|Lil : (10曙3000)mg。
玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA)偶联物的制备将ZEN溶解在 3mL 100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加 入10ml 100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提 取3次~5次，每次10ml 20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5 3.5 左右，再用二氯甲烷提取3次 6次，每次10ml 20ml，收集二氯甲烷，过无水 硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间产物， 加入3 ml 50ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C 12°C下搅拌反应30分钟 45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml 50ml 蒸馏水和5ml 50ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8 9， 5°C~12°C下 搅拌反应5小时 6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次 5次，冷冻干 燥，偶联物-20。C -4(TC保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸 盐=(10~1000)mg : (10 2000)mg ， ZEN中间产物氯甲酸乙丁酯OVA = (10 1000)mg : (1(M000)pl : (10-3000)mg。
所述抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体及其溶液的制备取ZEN-BSA偶 联物用生理盐水配成0.1iAg/)il 10 pg/W抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀， 充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏 佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为1(^ig/只 100^ig/只小鼠， 以后每隔2周~4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10jng/ 只 100iig/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小 鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:l比例混合，离心，去除 上清，在50 S 90 S内将0.1 ml 10 ml 50%聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞 中，充分混匀，使其融合，1分钟 3分钟后加入10ml 50mlDMEM培养液， 终止融合，水浴静止10分钟 30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5 30 %小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为^104 1><106饲养细胞 /0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%~10%CO2， 35。C 45。C条件下培养，5天 10天后，每培养孔更换"3HT培养液，10天 20 天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非
竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)为包被抗原，以免疫 小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性 细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)》山对分泌阳性抗 体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养 瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取lml稀释20 倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为 止；对10周龄 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只 0.5ml/只，8 天 10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5><105细胞/只，5天后注意 观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-2(TC -4(TC保存；上述反应成分的 比例为ZEN-BSA :生理盐水=(10~1000)pg : (0.1 10)ml。
所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；所 述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过氧化氢 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液； 所述终止液为硫酸溶液。
玉米赤霉烯酮的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于取包被有ZEN-OVA 的微孔包被板，加入50pL ~100 的ZEN标准品或处理好的样品到各自的微孔 中，加50juL 100jLiL抗ZEN抗体，35。C 45'C孵育0.5小时~1小时，洗涤液洗3 次~5次，加50pl 100nl辣根过氧化物酶(服P)-羊抗鼠抗体，35°045°0孵育 0.5小时 1小时，用洗涤液洗3次~5次，加50jiL 100 )iL显色液A和50jaL 100 显色液B，暗处静置10分钟 20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值， 从标准曲线计算样品中的ZEN含量。
本发明的玉米赤霉烯酮的酶联免疫吸附检测方法操作简便，检测快速、灵 敏、准确，专用测试盒使用方便、价格低，适用于大批量样品的检测。
图1为玉米赤霉烯酮ZEN标准曲线图。 具体实施例方式
一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其包括洗涤液l、显色液A、显色 液B和终止液IO，其还包括包被板12、玉米赤霉烯酮标准品ll、玉米赤霉烯酮 单抗冻干品5和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品6。
测试盒的制备其包括以下步骤，包被板的制备、玉米赤霉烯酮标准品的 制备、玉米赤霉烯酮单抗冻干品的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。
下面结合实施例描述测试盒的加工过程
实施例1
包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用lOmmol / L pH9.5 Na2COrNaHC03的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA) 稀释至1.0Pg/mL， 96或48或24孔微孔板各孔加100W， 5'C放置过夜，弃去包 被液，洗涤2次，按加入含5%牛血清白蛋白，pH7.5的磷酸盐缓冲液，8t:封 闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20'C冷冻保存；
玉米赤霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液为去离子水， ZEN浓度为25ng/mL;
玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)偶联物的制备将ZEN溶解在100mL 吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入55ml蒸馏 水，用氢氧化钠溶液调PH为9左右，再用二氯甲烷提取3次，每次15ml，弃去 二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2. 5左右，再用二氯甲垸提取5次，每次20ml， 收集二氯甲垸，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产 物；取ZEN中间产物，加入3ml二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，8.5。C下搅拌反 应45min，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml蒸馏水 和5ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8.5， 5'C下搅拌反应5. 5小时， 然后，以蒸馏水进行透析，换液3次，冷冻干燥，偶联物-3(TC保存；上述反应 成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐二10mg : 2000mg ， ZEN中间产物氯 甲酸乙丁酯BSA = 10mg : 1000W : 1450mg。
玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA)偶联物的制备将ZEN溶解在51mL吡啶 中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8. 5左右，再用二氯甲烷提取4次，每次15ml，弃去二 氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为3左右，再用二氯甲垸提取6次，每次10ml， 收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产 物；取ZEN中间产物，加入50ml二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，8.5°C下搅拌 反应30分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于27.5ml 蒸馏水和50ml 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8. 5， 12"C下搅拌反应5小 时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次，冷冻干燥，偶联物-3(TC保存；上述 反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐=10mg : 2000mg ， ZEN中间 产物氯甲酸乙丁酯OVA = 500mg : : 1500mg。
所述抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体及其溶液的制备取ZEN-BSA偶 联物用生理盐水配成10 PgA4抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化， 供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次 免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为55iag/只小鼠，以后每隔4周加强免 疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10Mg/只，最后一次免疫采用脾内 注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细 胞SP-2/0以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S内将10ml50X聚乙二醇 (分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1分钟后加入30 ml DMEM 培养液，终止融合，水浴静止20分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含30 %小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1 X 104饲养细胞/0.1 ml 接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于7.5%(302， 4(TC条件 下培养，IO天后，每培养孔更换、HT培养液，15天后，开始对镜检有杂交瘤 克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限 稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐 毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以 SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A WJr A 空白)/(A对照-A舶)〉2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将 阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数， 稀释为70个/ml，再取l ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆， 直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对11.5周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.4ml/只，8天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5X1()S细胞/ 只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-2(TC保存；上述反 应成分的比例为ZEN-BSA :生理盐水=490 Mg : 10ml。 实施例2
包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用55mmol / L pH9 Na2COrNaHC03的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)稀释至 0.55Hg/mL， 96或48或24孔微孔板各孔加IOOW， 2'C放置过夜，弃去包被液， 洗涤5次，按加入含1%牛血清白蛋白，pH7的磷酸盐缓冲液，5。C封闭过夜， 弃去封闭液，吹干，板条密封后置-4(TC冷冻保存；
所述玉米赤霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液为去离 子水，ZEN浓度为50ng/mL;
玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)偶联物的制备将ZEN溶解在3mL 吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入100ml蒸 馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5左右，再用二氯甲垸提取5次，每次10ml， 弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为3.5左右，再用二氯甲垸提取6次，每 次15ml，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN 中间产物;取ZEN中间产物，加入50ml二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C下 搅拌反应30分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于50ml 蒸馏水和50ml 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8， 12°C下搅拌反应5小 时，然后，以蒸馏水进行透析，换液5次，冷冻干燥，偶联物-2(TC保存；上述 反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐=1000mg : 970mg ， ZEN中间产物-氯甲酸乙丁酯BSA 二1000mg : 10^1 : 3000mg。
玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA)偶联物的制备将ZEN溶解在3raL吡啶 中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入45ml蒸馏水， 用氢氧化钠溶液调pH为9.5左右，再用二氯甲垸提取5次，每次20ml，弃去二 氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为3. 5左右，再用二氯甲烷提取3次，每次20ml， 收集二氯甲垸，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产 物；取ZEN中间产物，加入3ml二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，12。C下搅拌反 应45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于50ml蒸馏水和27.5ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8， 8.5t:下搅拌反应6小 时，然后，以蒸馏水进行透析，换液5次，冷冻干燥，偶联物-2(TC保存；上述 反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐二 505mg : 1005mg ， ZEN中间产 物氯甲酸乙丁酯OVA 二 1000mg : 505W : 3000mg。
抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体及其溶液的制备取ZEN-BSA偶联物用 生理盐水配成0.1 PgAil抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化， 供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次 免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为100Pg/只小鼠，以后每隔2周加强 免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量100Pg/只，最后一次免疫采用 脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓 瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在90S内将0. lml50X聚 乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，3分钟后加入50 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含 17. 5X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1 X 106伺养细胞/0. 1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的％孔培养板中，于10%C02， 45°。条 件下培养，5天后，每培养孔更换2/3 HT培养液，IO天后，开始对镜检有杂交 瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有 限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争EUSA法进行，以呕 吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以 SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(Aa验-A 空白)/(A对照-Ae自)〉2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将 阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数， 稀释为70个/ml，再取l ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆， 直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体 石蜡0.5 ml/只，10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5乂105细胞/ 只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-30。C保存；上述反 应成分的比例为ZEN-BSA :生理盐水=10Pg : 5.05ml。
实施例3
包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用lOOmmol / LpHIO Na2COrNaHC03的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA) 稀释至O.lPg/Ri L， 96或48或24孔微孔板各孔加1004， 8。C放置过夜，弃去 包被液，洗涤3次，按加入含3%牛血清白蛋白，pH8的磷酸盐缓冲液，2。C封 闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-3(TC冷冻保存；
玉米赤霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液为去离子水， ZEN浓度为0.001 ng/mL;
玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)偶联物的制备:将ZEN溶解在51. 5mL 吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10ml蒸馏 水，用氢氧化钠溶液调pH为9.5左右，再用二氯甲垸提取4次，每次20ml，弃 去二氯甲烷,水层用盐酸溶液调pH为3左右，再用二氯甲烷提取3次，每次10ml， 收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产 物；取ZEN中间产物，加入26. 5ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，12°C下搅 拌反应37.5分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于 27. 5ml蒸馏水和27. 5ml 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为9， 8. 5°C下搅 拌反应6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液4次，冷冻干燥，偶联物-40°C 保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐二495mg : lOmg ， ZEN 中间产物氯甲酸乙丁酯BSA 二 505mg : 505W : 10mg。
玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA)偶联物的制备将ZEN溶解在lOOmL吡 啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10ml蒸馏水， 用氢氧化钠溶液调pH为9左右，再用二氯甲垸提取3次，每次10ml，弃去二氯 甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5左右，再用二氯甲烷提取5次，每次15ml， 收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产 物；取ZEN中间产物，加入26.5ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5。C下搅拌 反应37.5分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml 蒸馏水和5ml 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为9， 5"下搅拌反应5. 5小时， 然后，以蒸馏水进行透析，换液4次，冷冻干燥，偶联物-4(TC保存；上述反应 成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐二1000mg : 10mg ， ZEN中间产物氯 甲酸乙丁酯OVA 二 10mg : 101^1 : 10mg。
抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体及其溶液的制备取ZEN-BSA偶联物用生理盐水配成5.05ktg/l4抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化， 供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次 免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为55^/只小鼠，以后每隔3周加强免 疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量100Mg/只，最后一次免疫采用脾 内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤 细胞SP-2/0以10:1比例混合，离心，去除上清，在70 S内将5.05ml 50%聚乙 二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，2分钟后加入30 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟后离心，去除上清；将融合细胞用 含5X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1X10S饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5XC02， 35'C条 件下培养，8天后，每培养孔更换2/3HT培养液，20天后，开始对镜检有杂交 瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有 限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕 吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以 SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试 验-A空白)/(A对照-A空白)".l;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有 限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计 数细胞个数，稀释为70个/ ml，再取lml稀释20倍，接种入96孔培养板中进 行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对13周龄Balb/c小鼠腹 腔注射液体石蜡0.3 ml/只，9天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5xl05 细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-40。C保存；上 述反应成分的比例为ZEN-BSA :生理盐水=1000 Pg : O.lml。
酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；所述洗 涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过氧化氢的柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述 终止液为硫酸溶液。
下面结合实施例描述测试盒检测方法
实施例1
取包被有ZEN-OVA的微孔包被板，加入100 PL的ZEN标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50叱抗ZEN抗体，4CTC孵育0.75小时，洗涤液洗5次， 加辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35'C孵育1小时，用洗涤液洗4 次，加50叱显色液A和75叱显色液B，暗处静置20分钟后加终止液，在450 nrn处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ZEN含量。 实施例2
取包被有ZEN-OVA的微孔包被板，加入50化的ZEN标准品或处理好的样品 到各自的微孔中，加IOO叱抗ZEN抗体，35"C孵育0.5小时，洗涤液洗3次， 加辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，45'C孵育0.5小时，用洗涤液 洗3次，加75ML显色液A和50吣显色液B，暗处静置10分钟后加终止液，在 450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ZEN含量。
实施例3
取包被有ZEN-OVA的微孔包被板，加入的ZEN标准品或处理好的样品 到各自的微孔中，加75叱抗ZEN抗体，45'C孵育1小时，洗涤液洗4次，加 75W辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，4(TC孵育0.75小时，用洗涤液洗5 次,加IOO叱显色液A和IOO叱显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm 处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ZEN含量。
权利要求
1、一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于其还包括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤霉烯酮单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
2、 一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其特征在于其包括以下步骤，包被板的制备、玉米赤霉烯酮标准品的制备、玉米赤霉烯酮单抗冻干 品的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。
3、 根据权利要求2所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其 特征在于所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10 mmol / L 100mmol / L pH9 10 Na2C03-NaHC03的缓冲液作为包被液，将呕 吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)稀释至O.lpg/m L ~1.0ng/m L， 96或48或24孔微 孔板各孔加100W， 2'C 8。C放置过夜，弃去包被液，洗涤2次 5次，按加入含 1 5%牛血清白蛋白，pH7 8的磷酸盐缓冲液，2'C 8。C封闭过夜，弃去封闭液， 吹干，板条密封后置-2trC -4(TC冷冻保存。
4、 根据权利要求2所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其 特征在于所述玉米赤霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液 为去离子水，ZEN浓度为0.001 ng/mL 50ng/mL。
5、 根据权利要求2所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其 特征在于，所述玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)偶联物的制备将ZEN 溶解在3mL 100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹 千，加入10ml 100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5 9.5左右，再用二氯 甲烷提取3次 5次，每次10ml 20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH 为2.5 3.5左右，再用二氯甲烷提取3次~6次，每次10ml 20ml，收集二氯甲烷， 过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹千，得到ZEN中间产物；取ZEN中间 产物，加入3ml 50ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5。C 12。C下搅拌反应30 分钟 45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于 5ml 50ml蒸馏水和5ml 50ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8 9， 5°C 12"下搅拌反应5小时 6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次 5次，冷冻干燥，偶联物-4(TC一2(TC保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟 胺盐酸盐=(10 1000)mg : (10~2000)mg ， ZEN中间产物氯甲酸乙丁酯BSA =(10~1000)mg(10 1000)nl : (10隱3000)mg。
6、 根据权利要求2所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其 特征在于，玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA)偶联物的制备将ZEN溶解在 3mL 100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加 入10ml 100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提 取3次~5次，每次10ml 20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5 3.5 左右，再用二氯甲烷提取3次 6次，每次10ml 20ml，收集二氯甲烷，过无水 硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间产物， 加入3ml 50ml二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5。C 12。C下搅拌反应30分钟 45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml 50ml 蒸馏水和5ml 50ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8 9, 5°C~12°C下 搅拌反应5小时 6小时，然后以蒸馏水进行透析，换液3次 5次，冷冻干燥， 偶联物-4(TC -2(TC保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐= (10 1000)mg : (10 2000)mg ， ZEN中间产物氯甲酸乙丁酯OVA = (10~1000)mg : (10~1000)pl : (10-3000)mg。
7、 根据权利要求2所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其 特征在于，所述抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体及其溶液的制备:取ZEN-BSA 偶联物用生理盐水配成0.1pg/pl 10 pg l抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混 匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全 福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10pg/只 100 )ig/只 小鼠，以后每隔2周 4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量 1(Hig/只 100pg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免 疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心， 去除上清，在50S 90S内将0.1 10ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞 中，充分混匀，使其融合，l分钟 3分钟后加入10ml 50mlDMEM培养液， 终止融合，水浴静止10分钟~30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5% 30X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为^104 1><106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作伺养层的96孔培养板中，于5。％ ~10%CO2， 35'C 45'C条件下培养，5天 10天后，每培养孔更换2/3 HT培养液， 10天 20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选， 对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗 原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)为包被抗原， 以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照； 阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)〉2.1;对分泌阳 性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至 培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取l ml稀 释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈 阳性为止；对10周龄 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3 ml/只 0.5 m1/ 只，8天 10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5"05细胞/只，5天 后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-4(TC -2(TC保存；上述反应 成分的比例为ZEN-BSA :生理盐水=(10~1000)|ig : (0.1 10)ml。
8、 根据权利要求2所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其 特征在于，所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干 品；所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过 氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇 溶液；所述终止液为硫酸溶液。
9、 一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的检测方法，其特征在于取包 被有ZEN-OVA的微孔包被板，加入50pL 100 的ZEN标准品或处理好的样品 到各自的微孔中，加50pL 100pL抗ZEN抗体，35。C 45。C孵育0.5小时~1小时， 洗涤液洗3次 5次，加50]!l 100nl辣根过氧化物酶(服P)-羊抗鼠抗体，35°C 45。C孵育0.5小时 1小时，用洗涤液洗3次 5次，加50|iL ~100 pL显色液A 和50pL 100 ^L显色液B，暗处静置10分钟 20分钟后加终止液，在450 nm 处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ZEN含量。
全文摘要
本发明为一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其检测快速、灵敏、准确、操作简便、且对样品纯度要求不高，特异性强，适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了测试盒的制备及检测方法。其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于其还包括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤霉烯酮单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品；检测时取包被板，加入50μl～100μl的ZEN标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl～100μl抗ZEN抗体，35℃～45℃孵育0.5小时～1小时，洗涤液洗3次～5次，加50μl～100μl辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35℃～45℃孵育0.5小时～1小时，用洗涤液洗3次～5次，加50μl～100μl显色液A和50μl～100μl显色液B，暗处静置10分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ZEN含量。
文档编号G01N33/577GK101413955SQ20081023633
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月7日 优先权日2008年11月7日
发明者张建中, 徐祖奇, 毛丽华 申请人:无锡益达生物技术有限公司