一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，属于食品安全检测技术领域。
【背景技术】
[0002]玉米赤霉稀酮(Zearalonone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。1962年Stob等首先从发霉的玉米种分离得到了该毒素，命名为玉米赤霉稀酮；其主要衍生物为α-玉米赤霉稀醇(a-zearalenol)和β -玉米赤霉稀醇(β-zearalenol) ο
[0003]ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，会对动物及人类造成危害，主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。
[0004]目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉稀酮的含量不能超过0.05mg/kg ;意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉稀酮的含量不能超过0.lmg/kg ;而在法国，植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于0.2mg/kg0我国GB 13078.2-2006规定配合饲料、玉米中ZEN的MRL值为500 yg/kg，GB2761-2011规定小麦(粉)、玉米(面、渣、片)中ZEN的MRL值为60 μ g/
kg ο
[0005]玉米赤霉烯酮及其衍生物的主要检测方法有薄层色谱法(TLC)、高压液相色谱法(HPLC)及质谱联用技术、酶联免疫吸附法(ELISA)和近几年发展起来的胶体金免疫层析法(GICA)。薄层色谱法是应用最早、最广的分析技术，但灵敏度低、重现差、操作烦琐、时间长且安全性差等缺点，已越来越不适用现代分析。高压液相色谱法及质谱联用技术是目前国内测定玉米赤霉烯酮使用最多、也最权威的方法，但前处理相对复杂、检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多。目前，仅有适用于检测谷物中玉米赤霉烯酮含量的试纸条，未有专门用于检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术的不足，本发明提供了一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，采用的技术方案如下:
[0007]本发明的目的在于提供一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，该试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，反应膜3，吸水垫4和底板5，其特征在于，反应膜3位于底板5中间，反应膜3的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫1和胶体金结合垫2，另一侧设有吸水垫4 ;所述胶体金结合垫2和吸水垫4均与反应膜3交叠连接；所述反应膜3上设有检测线31和控制线32 ;所述检测线31上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；所述控制线32上包被有羊抗鼠IgG ;所述玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物在检测线31上的包被量为每厘米检测线上包被2.0ug ;所述羊抗鼠IgG在控制线32上的包被量为每厘米质控线32上包被0.8ugo
[0008]优选地，所述样品垫1长18mm?20mm，宽4mm?5mm ;所述胶体金结合垫2长5mm?7臟，宽4mm?5臟；所述吸水塾4长18mm?20臟，宽4mm?5臟。
[0009]优选地，所述检测线31和控制线32间距4mm-7mm。
[0010]优选地，所述吸水垫4与反应膜3交叠3.lmm-3.7mm ;所述胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.lmm-3.5mm ;所述样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.lmm-3.5mm。
[0011]优选地，所述玉米赤霉稀酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，喷涂浓度为2mg/mL、喷量为1.0 μ L/cm ;所述羊抗鼠IgG，喷涂浓度为lmg/mL、喷量为0.8 μ L/cm。
[0012]优选地，所述胶体金结合垫2的制备方法如下:
[0013]1)抗体-胶体金标记物溶液的制备??每lmL胶体金溶液，加入1 μ L 0.lmol/L1(20)3和3 μ L0.9mg/mL抗玉米赤霉烯酮单抗，混匀后避光静置15min ;然后加入100 μ L10%BSA溶液，混匀后避光静置15min ;于4°C、lOOOOr/min下离心15min，将弃去上清液后所得的沉淀用100 μ L20mM复溶液溶解，获得抗体-胶体金标记物溶液，4°C保存备用；所述复溶液为包含1% BSA、0.5% Tween20和5%海藻糖，且pH值为8.0的硼酸缓冲溶液；
[0014]2)将待处理的金标垫浸泡于含0.5% Tween 20且pH为8.0的PBS溶液中，均匀浸湿后45°C烘干2h备用，获得预处理金标垫；
[0015]3)将步骤1所制备的抗体-胶体金标记物溶液用步骤1所述复溶液按照体积比为1: 4进行稀释，获得抗体-胶体金标记物溶液的稀释液；
[0016]4)取步骤2所得预处理金标垫浸泡于步骤3所制备的抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，每6cm预处理金标垫浸于100 μ L抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，置于37°C烘干lh，获得胶体金结合垫2，置于干燥环境备用。
[0017]优选地，所述待处理的金标垫，为玻璃纤维膜。
[0018]优选地，所述反应膜3，为硝酸纤维素膜。
[0019]优选地，所述样品垫1，处理方法是将其浸于50mM硼酸缓冲液中，均匀浸湿后于45°C烘干备用；所述硼酸缓冲液包含1% BSA，0.5% Tween 20,2% PVP和5%海藻糖，pH值为 8.0。
[0020]本发明还提供了一种利用上述任一试纸条检测乳中玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下:
[0021]1)在待检样品中加入等体积的乙腈，在5000r/min下离心5min，吸取上清液获得样品提取液；
[0022]2)取步骤1所得样品提取液滴加在权利要求1-8所述任一试纸条的样品垫1上，8min后观察检测结果；检测线31出现红色条带，样品呈阴性，检测线31未出现红色条带，样品呈阳性；若控制线32上无条带，试纸条无效。
[0023]本发明所述检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条是用于非诊断目的的，是检测可以作为原料乳来源的乳，如牛乳、羊乳等。
[0024]本发明有益效果:
[0025]本发明提供了一种乳中玉米赤霉烯酮残留检测试纸条，适应现代检测快速、简捷、现场化的要求。本发明试纸条操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、灵敏度高。检测范围为30ng/ml?200ng/ml，检测限可低达30ng/ml,检测时间可控制在10分钟以内。试纸条稳定性较好，试纸条分别在4°C和25°C下密封保存3个月，灵敏度未发生改变；37°C密封保存的试纸条15d内灵敏度保持不变。
【附图说明】
[0026]图1试纸条结构组成示意图；
[0027](1，样品垫；2，胶体金结合垫；3，反应膜；31，检测线；32，控制线；4，吸水垫；5，底板)。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0029]实施例1:
[0030]1.金标垫的制备
[0031]1.1胶体金溶液的制备:柠檬酸三钠法
[0032]试验用玻璃器皿要预先进行酸化和硅化。取100ml双蒸水倒入三角瓶，画一条100ml的线。用移液器吸出1ml水，加入lml氯金酸，低转速煮沸，要保证三角瓶放平，加入1.5ml柠檬酸三钠，颜色不变时再煮15min，然后转凉至完全凉，最后用双蒸水定容。用紫外风光光度计和透射电镜鉴定胶体金的质量，胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，用透射电镜测得颗粒大小为25?40nm。
[0033]1.2抗体最佳标记量的确定
[0034]采用Mey氏稳定化实验，取16个2ml EP管，每管加入lml胶体金，分别标为1?16号做正交实验。其中1、5、9、13号管不加1(20)3，2、6、10、14号管中加入1111 K2C03，3、7、11、15号管中加入2ul K2C03，4、8、12、16号管中加入3ul K2C03。将抗玉米赤霉烯酮单抗稀释至0.9mg/ml, 1?4号管每毫升胶体金溶液标记lul抗体，5?8号管标记2ul抗体，9?12号管标记3ul抗体，13?16号管标记4ul抗体，混匀、避光静置15分钟。各管中加入20ul10% NaCl，混匀后避光静置15分钟。保持红色的最低添加组一K2C03 lul，抗体2ul是抗体最小标记量及最适K2C03添加量；抗体最小标记量的1.5倍，即抗玉米赤霉稀酮单抗的最适标记量为3ul 0.9mg/ml0
[0035]1.3抗体-胶体金标记物的制备
[0036]取已制备好的胶体金溶液lmL,加入lul 0.lmol/L K2C03，按3ul 0.9mg/ml抗玉米赤霉烯酮单抗，边搅拌边加入抗玉米赤霉烯酮单抗，振荡混匀后避光静置15min。加入10%BSA100ul，振荡混匀，避光静置15分钟。4°C离心(10000r/min，15min)后弃上清，去除未结合的蛋白质，将沉淀用100ul含1% BSA、0.5% Tween 20、5%海藻糖的20mM硼酸缓冲液(pH 8.0, 20mM)溶解；4°C保存备用。
[0037]1.4抗体-胶体金标记物复溶液的选择
[0038]分别对抗体-胶体金标记物复溶液的离子强度(20、50、100mM)，pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，BSA 含量(1%,2%,3% )，表面活性剂(Tween 20、PVP、PEG 2000)及含量(0.5%、1%、2% )，海藻糖含量(5%、10%、15% )进行优化，通过T线显色情况确定选用20mM的硼酸缓冲液(PH 8.0.1% BSA、0.5% Tween 20、5%海藻糖)为抗体-胶体金标记物复溶液。
[0039]1.5抗体-胶体金标记物的最佳包