检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外诊断技术领域，特别是涉及一种基于纳米磁微粒化学发光及碱性磷酸酶标记检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]甲状腺球蛋白(T g )是一种存在于甲状腺卵泡细胞中的大的异源糖蛋白(丽660，000)。甲状腺球蛋白在甲状腺激素、T3和T4的生物合成中起着非常重要的作用。在甲状腺卵泡细胞中，甲状腺过氧化酶(ΤΡ0)对甲状腺球蛋白内的酪氨酰基团的碘化反应中起催化剂的作用。经过碘化的甲状腺球蛋白将保存在卵泡胶体中，充当T3和T4的保存器。当甲状腺受到刺激时，甲状腺球蛋白将会降解，此时甲状腺激素、T3和T4就会释放到血液中。
[0003]甲状腺球蛋白自身抗体的检测是鉴定患者是否患有自身免疫性甲状腺疾病的一种有效手段。80-100%患有淋巴瘤性甲状腺炎或慢性甲状腺炎的病人、10-20%患有亚急性甲状腺炎的病人和60-70%患有甲状腺机能亢进的病人，他们的抗Tg抗体水平升高。由于甲状腺球蛋白的异质性，使得抗甲状腺球蛋白抗体在患有其他病症的老年病人以及临床表现正常和甲状腺机能正常的患者身上也同样可以被检测出。还在患有阿狄森氏病(慢性肾上腺皮质机能减退症)和某些I型糖尿病的病人体内检测出抗甲状腺球蛋白抗体。
[0004]甲状腺球蛋白抗体现常用的检测方法有放射免疫分析和普通微孔板酶联免疫分析等，但这些方法存在一些问题。放射免疫分析(RIA)存在高放射性、有效期短、给操作者带来的健康隐患及对环境的污染等缺点，普通微孔板酶联免疫分析(EIA)存在精密度差、灵敏度差、无法实现定量检测等缺点，也不容易实现全自动化。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题是提供一种检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒及方法，具有极易实现全自动化、灵敏度高、精密度高、线性范围宽等优点。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括第一试剂、第二试剂、磁分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，所述第一试剂为甲状腺球蛋白标记生物素试剂，所述第二试剂为甲状腺球蛋白酶结合物试剂，所述磁分离试剂为链霉亲和素标记的超顺磁纳米磁微粒试剂。
[0007]在本发明一个较佳实施例中，所述第一试剂或者为甲状腺球蛋白标记FITC抗原试剂；所述第二试剂中的所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述第一试剂和所述第二试剂中的甲状腺球蛋白为人源性的天然提取抗原或基因重组抗原。
[0008]在本发明一个较佳实施例中，所述磁分离试剂为超顺磁纳米磁微粒，磁珠表面为甲苯磺酰基活化，所述磁分离试剂的直径为1.05 Mm，等电点是pH 5.0，在pH 7时，电荷为-10 mV，铁含量为26% ;所述超顺磁纳米磁微粒直接或间接标记链霉亲和素。
[0009]在本发明一个较佳实施例中，所述化学发光底物为AMPH)和增强剂的混合物；所述清洗液为浓缩清洗液。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，所述磁分离试剂的制备方法为:将所述磁微粒用0.04-0.06mol/L、pH值为4.5-5的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为8~12mg/ml ;然后加入所述链霉亲和素，在15~40°C下混悬30~60分钟，其中所述磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为25~50:1 ;然后再加入新鲜配制的8~12mg/ml的碳二亚胺水溶液，在15~40°C下混悬2~12h，其中所述2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述碳二亚胺水溶液的体积比为10~20:1 ;磁分离，去上清，用含质量比为0.09-1.1%的牛血清白蛋白、pH值为7~7.5、物质的量浓度为0.009-0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到所述偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2-1.0mg/ml，即得所述磁分离试剂；
所述甲状腺球蛋白(Tg)标记生物素试剂的制备方法为:将所述甲状腺球蛋白(Tg)用0.01-0.03mol/L、pH值为7~7.5的PBS缓冲液，在2~8°C下透析过夜，配制成甲状腺球蛋白(Tg)溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配制成N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的物质的量浓度为8~12mM ;将所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液加入到所述的甲状腺球蛋白(Tg)溶液中，混合均匀，在15~40°C下放置20~40分钟；加入0.9-1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15~40°C下放置8~12分钟，然后用含质量比为2.5-3.2%的牛血清白蛋白、pH值为7~7.5、物质的量浓度为0.04-0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的甲状腺球蛋白(Tg)的浓度为0.2-2.5 μ g/ml，即得所述的甲状腺球蛋白(Tg)标记生物素试剂；
所述甲状腺球蛋白(Tg)酶结合物试剂的制备方法为:将甲状腺球蛋白(Tg)加入到浓度为8~12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15~40°C下静置18~25分钟，加入0.09-0.llmol/L的甘氨酸溶液，在15~40°C下静置4~5分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后甲状腺球蛋白(Tg)，2~8°C保存备用；将碱性磷酸酶溶液加入到4~5mg/ml的4_(N_马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15~40°C下静置25~35分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2~8°C保存备用；将活化后的甲状腺球蛋白(Tg)和活化后的碱性磷酸酶混合，在2-8°C下静置12~24h，用SUpperdeX200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2~8°C下保存备用；将所述连接物浓溶液用含质量比为0.4-0.6%的牛血清白蛋白、pH为7.8-8.0、物质的量浓度为0.09-0.llmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白(Tg)的浓度为0.2~1 μ g/ml,即得所述的甲状腺球蛋白(Tg)酶结合物试剂。
[0011]提供一种检测甲状腺球蛋白抗体的方法，包括步骤为:
步骤1:在检测管中加入待测样本原液，然后依次加入第一试剂和磁分离试剂，混匀，在36~38°C下温育14~16分钟；
步骤2:添加磁场，使步骤1温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；
步骤3:添加磁场，使步骤2混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入第二试剂，混匀，在36~38°C下温育14~16分钟；
步骤4:添加磁场，使步骤3温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬； 步骤5:添加磁场，使步骤3混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值。
[0012]本发明的有益效果是:本发明的检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒及方法，克服了放射免疫分析的高污染、有效期短和普通微孔板酶联免疫分析精密度差、灵敏度差的缺点，使用碱性磷酸酶酶促化学发光系统、磁微粒分离系统、独特的抗原抗体偶联技术，使得该方法的灵敏度、精密度、稳定性、有效期、安全性、环保性能大大提高。
【附图说明】
[0013]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中:
图1是本发明的甲状腺球蛋白抗体检测方法中校准品标准曲线图；
图2是本发明的甲状腺球蛋白抗体检测方法中血清样本检测结果相关性图。
【具体实施方式】
[0014]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0015]实施例一:
提供一种检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括第一试剂、第二试剂、磁分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，所述第一试剂为甲状腺球蛋白(Tg)标记生物素试剂，所述第二试剂为甲状腺球蛋白(Tg)酶结合物试剂，所述磁分离试剂为链霉亲和素标记的超顺磁纳米磁微粒试剂。
[0016]所述磁分离试剂包括:超顺磁纳米磁微粒基于甲苯磺酰基活化的磁珠疏水性磁珠表面，所述磁分离试剂的直径为1.05 Mm，等电点是pH 5.0，在pH 7时，电荷为-10 mV，铁含量为26%。所述超顺磁纳米磁微粒直接或间接标记链霉亲和素。所述超顺磁纳米磁微粒不局限于标记链霉亲和素，也可以标记抗FITC抗体。
[0017]所述第一试剂和所述第二试剂中的甲状腺球蛋白(Tg)是人源性的天然提取抗原或基因重组抗原。所述甲状腺球蛋白(Tg)标记生物素试剂，但不局限于甲状腺球蛋白(Tg)标记生物素，也可以是甲状腺球蛋白(Tg)标记FITC抗原。所述甲状腺球蛋白(Tg)酶结合物试剂中所述酶可以是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0018]所述化学发光底物的主要组分可以是AMPH)及各种有效增强剂。所述清洗液可以为浓缩清洗液。
[0019]所述磁分离试剂的制备方法为:将所述磁微粒用0.04-0.06mol/L、pH值为4.5-5的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为8~12mg/ml ;然后加入所述链霉亲和素，在15~40°C下混悬30~60分钟，其中所述磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为25~50:1 ；然后再加入新鲜配制的8~12mg/ml的碳二亚胺水溶液，在15~40°C下混悬2~12h，其中所述2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述碳二亚胺水溶液的体积比为10~20:1 ;磁分离，去上清，用含质量比为0.09-1.1%的牛血清白蛋白、pH值为7~7.5、物质的量浓度为0.009-0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到所述偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2-1.0