通过质谱法定量甲状腺球蛋白的制作方法
【专利说明】通过质谱法定量甲状腺球蛋白
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请根据《美国法典》第35卷第119节第五款（35U.S.C. § 119(e))的规定要 求2012年9月20日提交的美国临时申请序列号：61/703,721的权益，其全部内容通过引 用并入本发明。 发明领域
[0003] 本发明涉及甲状腺球蛋白的定量。在特定方面，本发明涉及通过质谱法定量甲状 腺球蛋白的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 本公开背景的以下描述仅仅作为理解本发明的辅助而提供，且不认为对本发明描 述或构成现有技术。
[0006] 甲状腺球蛋白或Tg是分子量为660kDa的大二聚体分泌性糖蛋白，其由非共价结 合的同型二聚体组成。
[0007]Tg分子以几种形式存在。在UniProtKnowledgebase(Swiss-Prot+TrEMBL)找到 的三种主要的Tg分子序列是P01266(人甲状腺球蛋白前体）、P01266-2 (P01266的同种型 2)和Q59GF02(人甲状腺球蛋白变体）（分别参见图1、2和3)。
[0008] P01266是P01266的主要变体，其长度为2768个AA;P01266-2是P01266的同种 型，其长度为2711个AA。P01266-2与P01266在Tg的1510至1567位氨基酸不同；Q59GF0 是甲状腺球蛋白片段，其长度为1574个AA。Q59GF0包含Tg的1212至2768位的氨基酸。
[0009] Tg只能在甲状腺中产生，可由正常良好分化的良性甲状腺细胞或甲状腺癌细胞产 生。其为用于甲状腺激素合成的前体蛋白，并充当甲状腺碘储存的基质。Tg由甲状腺用来 产生甲状腺激素甲状腺素（T4)和三碘甲腺原氨酸（T3)。血液中的Tg水平可用作分化型甲 状腺癌〇)TC)的肿瘤标志物。血液中高水平的Tg并非单独为甲状腺癌的指示物，而是在甲 状腺手术切除之后Tg在血液内的存留指示甲状腺组织的存留。在甲状腺手术切除之后检 测血液中Tg后的治疗过程可包括施用放射性碘以切除所有剩余的正常甲状腺。切除所有 正常甲状腺之后血液中Tg的继续存留可指示仍然存在一定量的肿瘤。
[0010] 已经开发了几种定量Tg的方法。例如Spencer,et al.,Thyroid, 1999, 9 (5) :435-41andPersoon,etal.,ClinicalChem 2006, 52(4) :686-691公开免疫测定法、放射性免疫测定法、以及免疫化学发光分析法用于 定量Tg。这些方法均面临方法学问题，如标准化的不同、批间分析灵敏度和精确度的变化 性、钩状效应和由Tg抗体造成的干扰。由Tg抗体造成的干扰问题尤其对监测Tg水平作为 肿瘤标志物的临床应用造成困难，因为高达20%的甲状腺癌患者具有Tg自身抗体。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明提供通过包括串联质谱法的质谱法定量样品中Tg的方法。
[0013] -方面，提供确定试样中Tg的量的方法，包括：（a)对含Tg的试样进行消化，引起 Tg肽的产生；(b)纯化一种或多种Tg肽；（c)电离一种或多种Tg肽；（d)通过质谱法检测 Tg肽离子（一种或多种）的量；和（e)使所检测的Tg肽离子（一种或多种）的量与试样 中Tg的量相关联。制备Tg肽的优选的酶为胰蛋白酶。用于该方法的合适的Tg肽为可通 过质谱法评价且可从可由除了Tg之外的蛋白质生成的有关肽中充分纯化的Tg肽。一种这 样的肽的示例为肽T129 (序列VIFDANAPVAVR;SEQIDNO:1)，其包含Tg第1579至1590位 的氨基酸，分子量为大约1，270Da，且在Tg的所有三种同种型中存在。参见图4。
[0014] 肽T129的形成提供了针对甲状腺球蛋白特有的胰蛋白酶生成肽。并且，从Tg的 胰蛋白酶消化而产生肽T129应当不受Tg抗体存在或不存在的影响。因此，测量试样中肽 T129的增加提供定量试样中初始Tg的量而不受Tg抗体干扰影响的方法。
[0015] 可使用任何合适的方法确定由样品中Tg消化引起的Tg肽的量。在试样可包含内 源Tg肽的情况下，可采取步骤确保内源肽不与通过消化样品中Tg生成的肽相混淆。一种 途径是在消化Tg之前从样品中去除内源Tg肽。其可例如利用尺寸分离技术完成。另一种 途径是根据本发明要求保护的方法分析部分试样，但除去消化步骤，从而建立试样中内源 肽的基准水平。在这种途径中，一旦确定基准，其可从消化后的肽水平中减去，消化后的肽 水平表示内源肽和消化生成的肽。
[0016]由于该方法可应用于复杂的试样（尤其是体液或源自组织的试样），可采取步骤 在消化之前纯化试样中的Tg。这可例如利用尺寸分离技术完成。
[0017] 在一些实施方式中，方法包括生成一种或多种Tg肽离子，其中至少一种该离子 具有与（带单电荷或多电荷的）肽T129离子的质荷比（m/z)相当的质荷比。在优选的 相关实施方式中，方法包括生成一种或多种Tg肽离子，其中至少一种具有1272. 8±0. 5、 636. 4±0. 5、或424. 3±0. 5的m/z(相当于带单电荷、双电荷或三电荷的肽T129离子）。在 相关的优选实施方式中，方法可包括生成Tg肽离子的一种或多种碎片离子，其中至少一种 具有 541. 3±0. 5、612. 3±0. 5、726. 4±0. 5、797. 4±0. 5、912. 4±0. 5 或 1059. 5±0. 5 的m/ z;优选地，该碎片离子的一种或多种选自具有797. 4±0. 5、912. 4±0. 5和1059. 5±0. 5的 m/z的离子。
[0018] 在一些实施方式中，步骤（b)中的纯化使用至少一种尺寸分离技术完成。优选地， 尺寸分离技术可以是过滤、LC或其任何组合。在某些优选实施方式中，试样为体液或组织。 在一些实施方式中，包括额外的步骤，其中对第二量的试样进行步骤（b)至（e)，从而建立 一种或多种内源Tg肽的基准水平。在这些实施方式中，该基准水平可从在试样中检测的Tg 肽离子（一种或多种）的量中减去，以确定由原始试样中的Tg产生的Tg肽离子的量。在其 它实施方式中，方法包括在消化之前纯化试样中Tg的额外初始步骤。在这些实施方式中， 消化前纯化和/或步骤（b)中的纯化可各自使用至少一种尺寸分离技术完成。优选地，在 消化前纯化和步骤（b)中均使用的至少一种尺寸分离技术是过滤；更优选地，该过滤利用 具有分子量截止的分子量截止过滤器完成，该过滤器使得Tg保留在过滤器的上方，并使得 Tg肽跟随滤液通过。在相关实施方式中，分子量截止为大约2kD至300kD;更加优选地为大 约100kD至300kD。在这些实施方式中，两种过滤（预消化和步骤（b))可利用相同的过滤 器进行。
[0019] 在第二个方面，提供确定试样中Tg的量的方法，包括：（a)对含Tg的试样进行消 化，引起肽T129的产生；(b)纯化肽T129 ; (c)电离肽T129以生成具有636. 4±0. 5的m/z 的前体离子；（d)使肽T129前体离子碎裂，以形成一种或多种碎片离子，其中至少一种具有 大约797. 4±0. 5、912. 4±0. 5或1059. 5±0. 5的m/z;通过质谱法检测肽T129前体离子、一种或多种碎片离子、或二者的量；和（e)将所检测的离子（一种或多种）的量与试样中Tg 的量相关联。在某些优选实施方式中，试样为体液或组织。在一些实施方式中，包括额外的 步骤，其中对第二量的试样进行步骤（b)至（e)，从而建立一种或多种内源肽T129的基准水 平。在这些实施方式中，该基准水平可从在试样中检测的肽T129离子（一种或多种）的量 中减去，以确定由原始试样中的Tg产生的肽T129离子（一种或多种）的量。在其它实施 方式中，方法包括在消化之前纯化试样中Tg的额外初始步骤。在这些实施方式中，预消化 纯化和/或步骤（b)中的纯化可各自利用至少一种尺寸分离技术完成。优选地，在预消化 纯化和步骤（b)中均使用的至少一个尺寸分离技术为过滤；更优选地，该过滤利用具有分 子量截止的分子量截止过滤器完成，该过滤器使得Tg保留在过滤器的上方，并使得Tg肽跟 随滤液通过。在相关实施方式中，分子量截止为大约2kD至300kD;更优选地为大约100kD 至300kD。在这些实施方式中，两种过滤（预消化和步骤（b))可利用相同的过滤器进行。
[0020] 如本文使用的，术语"纯化（purification) "或"纯化（purifying) "不是指除感 兴趣分析物（一种或多种）之外将所有物质从样品中去除。相反，纯化是指相对于样品的 一种或多种其它组分富集感兴趣的一种或多种分析物的量的过程。本文使用的纯化不需要 使分析物从所有其它物质中分离。在优选的实施方式中，纯化步骤或过程可用于去除一种 或多种干扰物质，例如一种或多种将干扰该方法中使用的仪器运行的物质或可干扰通过质 谱法检测分析物离子的物质。
[0021] 如本文使用的，与不包含测量离子质量的定量测量有关的术语"大约"是指指示值 加上或减去10%。
[0022] 如本文使用的，术语"基本上所有的"是指任何大于50%、更优选地大于60%、更 优选地大于70%、更优选地大于80%、和更优选地大于90