一种高抗丝黑穗病的蛋白ZmWAK及其编码基因和其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种玉米ZmWAK蛋白及其编码基因与应用。该蛋白ZmWAK，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗丝黑穗病相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因可用来培育高抗丝黑穗病的玉米，为转基因植物的培育奠定了基础。
【专利说明】-种高抗丝黑穗病的蛋白ZmWAK及其编码基因和其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高抗丝黑穗病的蛋白及其编码基因和其 应用。
【背景技术】
[0002] 丝黑穗病是一种土传性系统病害，严重危害玉米和高粱的生产，最早报道于1914 年，如今已成为世界各个主要玉米产区的严重病害。在我国，丝黑穗病主要发生在东北的春 玉米产区，以及西北、内蒙等地。90年代初由于感病品种的种植，丝黑穗病发生率逐年升高， 每年造成产量损失达30万吨左右。2002年，东北地区玉米产区丝黑穗病大面积爆发，发病 面积达100万hm2以上，占东北三省总种植面积的20%左右，造成10-15%的玉米产量的损 失。
[0003] 丝黑穗病是由丝轴黑粉菌（Sporisoriumreilianum)特异引起的真菌性病害，发 病植株病瘿上的冬孢子进入土壤越冬，成为来年的主要初始侵染源。丝轴黑粉菌的冬孢子 在土壤中可以保持活力3-5年，萌发不需要生理休眠后熟过程。在土壤中不同亲和交配 型的冬孢子交配形成2倍体的侵染菌丝，进而侵染玉米幼苗。冬孢子侵染的最适温度为 23-30°C，土壤含水量较低或中等。
[0004] 玉米感染丝黑穗病后，前期并不表现出明显的症状，但是某些发病较重的植株在 早期可能出现植株矮化、分蘖增多的现象。成熟期的发病植株也只在雌雄穗上表现出典型 病征。雄穗被侵染后，不散粉，可形成病瘿，内部充满孢子。如果雌穗发病，表现为不吐花 丝，膨大增生，除苞叶外内部被冬孢子取代。在生育后期部分苞叶破裂散出黑粉孢子，内部 夹杂丝状寄主维管组织。除此之外，还经常可见发病植株的雄穗和雌穗表现畸形生长，雌雄 同生，雌穗叶状化等异常现象。由于丝黑穗病最终破坏的是玉米的花器官，因此它属于严重 破坏生产的绝产型病害，一旦发病，对产量影响巨大。
[0005] 使用化学杀真菌剂可以对丝黑穗病进行一定程度的防治，但是效果有限，并且增 加了农民的成本以及对环境的危害，因此培育和推广种植抗病品种是对丝黑穗病进行控制 的持续有效手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种高抗丝黑穗病的蛋白及其编码基因。所述高抗丝黑穗病 的蛋白命名为ZmWAK,来源于玉米（Zea mays)。
[0007] 本发明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白：
[0008] 1)序列表中的SEQIDNs.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009] 2)将序列表中的SEQIDNs. 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且与植物抗丝黑穗病相关的由1)衍生的蛋白质。
[0010] 序列表中SEQIDN2 . 2所示的氨基酸序列由730个氨基酸残基组成。
[0011]上述1)和2)所述的ZmWAK蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物 表达得到。上述1)和2)所述的ZmWAK蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQIDNs. 1的 第70-2259位核苷酸所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一 个或几个碱基对的错义突变后得到。
[0012] 编码所述ZmWAK蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0013] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0014] 所述蛋白的编码基因也属于本发明保护的范围。
[0015] 所述蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一：
[0016] 1)序列表中SEQIDNs:1第70-2259位的核苷酸序列；
[0017] 2)编码序列表中SEQIDN2 :2蛋白质序列的多核苷酸序列；
[0018] 3)序列表中SEQIDNs:3所示的核苷酸序列；
[0019] 4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNs:1或SEQIDNs:3限定的DNA序列 杂交的核苷酸序列；
[0020] 5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能 蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97% 以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0021] 上述高严谨条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS和IXSSC，(λ1%SDS各洗膜一次。
[0022] 其中，序列表中的SEQIDN2 :1由2517个核苷酸组成，其开放阅读框架（ORF)为 自5'末端第70-2259位核苷酸，编码序列表中SEQIDN2 :2所示的蛋白质，即本发明所述 的ZmWAK蛋白。
[0023] 含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明保 护的范围。
[0024] 所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
[0025] 所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的 3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。 所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达 载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动 子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物 进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化 的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记 物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。 从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0026] 所述重组表达载体具体为在出发载体PCAMBIA1300的多克隆位点插入具有SEQ IDNs:3所示核酸序列的DNA片段所得的质粒。
[0027] 扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。
[0028] 本发明的另一个目的是提供所述蛋白、所述编码基因或所述的重组载体、表达盒、 转基因细胞系或宿主菌在增强植物抗丝黑穗病中的应用。
[0029] 所述的应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉 米。
[0030] 本发明的还一个目的是提供所述蛋白、所述编码基因或所述的重组载体、表达盒、 转基因细胞系或宿主菌在培育转基因植物中的应用；所述转基因植物与所述目的植物相 t匕，所述转基因植物对丝黑穗病的抗性增强。
[0031] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米。
[0032] 本发明的还一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述编码基因或权 利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌导入目的植物，得到转基因植 物；所述转基因植物与所述目的植物相比，所述转基因植物对丝黑穗病的抗性增强。
[0033] 所述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米。
[0034] 本发明的还一个目的是提供一种分子标记，为下述1)或2):
[0035] 1) -条引物具有序列表中SEQIDN2 :4所示的核苷酸序列，另一条引物具有序列 表中SEQIDNs:5所不的核苷酸序列；
[0036] 2) -条引物的核酸序列为序列表中SEQIDN2 :4所示的核苷酸序列的反向互补 序列，另一条引物的核酸序列为序列表中SEQIDN2 :5所示的核苷酸序列的反向互补序 列。
[0037] 本发明的再一个目的是提供所述分子标记物在鉴定和/或检测所述编码基因或 待测植物是否抗丝黑穗病中的应用。
[0038] 所述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为使用分子标记genoWAK2进行转ZmWAK基因玉米鉴定的结果图。
[0040] 图2为转ZmWAK基因玉米与非转基因玉米的表型鉴定结果图。
[0041] 图3为转ZmWAK基因玉米与非转基因玉米的抗病率统计结果。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] 下述实施例中所用的材料Ji1037、丝轴黑粉菌和高感丝黑穗病自交系Huangza〇4 见文献ChenY,ChaoQ,TanG,ZhaoJ,ZhangM,JiQ,etal.Identificationand fine-mappingofamajorQTLconferringresistanceagainstheadsmutinmaize. TheorApplGenet2008:117:1241-52.和ZhaoX，TanG，XingY，WeiL，ChaoQ，ZuoW，et al.Marker-assistedintrogressionofqHSRltoimprovemaizeresistancetohead smut.MolecularBreeding2012;30:1077-88.的报道，公众可从中国农业大学获得上述材 料。
[0045] 下述实施例中所用的玉米材料HiII见文献ArmstrongC，GreenC，Phillips R.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformation response.Maizegeneticscooperationnewsletterl991.的报道，公众可从中国农业大 学获得上述材料。
[0046] 实施例I、玉米基因ZmWAK的制备
[0047] 1、总RNA的提取
[0048] 收集上一年发病植株病缨，置阴凉干燥处避光保存，作为第二年的接种源。利用 100目的筛子对病缨进行初筛，过滤掉植物残留的维管组织，收集黑粉孢子用于接种。将 高抗丝黑穗病玉米自交系Jil〇37接种丝轴黑粉菌48h后，使用Invitrogen公司提供的 TriZol试剂提取接种后的Ji1037根部组织总RNA。
[0049] 2、ZmWAK基因全长cDNA的获得
[0050] 第一链cDNA的合成使用试剂盒BDSMART?RACEcDNAAmplificationKit，RACE 所用引物序列为：
[0051] WAK-3'RACE: 5 ' -AACTACACCTTCAAGGCATCCGACC-3 '
[0052] WAK-5'RACE:5' -GACTTCGAACTGGAACCTGATCTCG-3'
[0053] 将上述5'和3'RACE产物克隆到pEASY-Tl载体(购买自北京全式金生物技术有限 公司）上，选择阳性克隆分别测序、拼接后即可获得ZmWAK基因全长cDNA的序列，如序列表 SEQIDNs:l所示，共2517bp，其中编码区长2190bp，该编码区序列如序列表中SEQIDNs: 1中第70-2259位核苷酸所示，编码序列表中SEQIDN2 :2所示的氨基酸序列，共730个氨 基酸残基。
[0054] 利用以下引物从Jil037的cDNA中扩增可得到ZmWAK编码区全长的cDNA转录本。
[0055] fIcWAKL: 5，-ATGTCATCACTCCTGTTGCGAG-3，
[0056] flcWAKR:5, -ATGTGCCGACCGACCATTC-3，
[0057] 经测序，上述引物对扩增出的核酸片段具有序列表中SEQIDNs:1的第70-2350 位核苷酸所示核酸序列，包含ZmWAK基因编码区核酸序列。
[0058] 实施例2、玉米基因ZmWAK的功能验证
[0059] (一 )、表达载体的构建
[0060] 通过对M〇17BAC文库的筛选，获得了一个包含候选区段的阳性克隆MO-J12。利用Sau3AI对阳性克隆进行部分酶切，选择电泳分离后片段大于IOkb的片段进行纯化回收。同 时，利用BamHI对pCAMBIA1300载体进行酶切纯化回收。将目的基因片段和载体酶切产物 用T4DNA连接酶，16°C连接过夜，电击转化。选择阳性克隆进行测序，结果表明插入载体的 序列为序列表中SEQIDNs:3所不的核酸序列，该序列包含有ZmWAK基因的基因组序列。将 该在PCAMBIA1300载体的BamHI酶切位点插入具有SEQIDNs:3所示核酸序列的DNA片段 的质粒命名为P1300-WAK。将该具有序列表中SEQIDNs:3第4001-10000位核苷酸序列的 片段命名为ZmWAK。
[0061] (二)、互补转基因试验
[0062] UHiII(感玉米丝黑穗病）的获得
[0063] 玉米材料HiII为亲本A和B的杂交F1，经过鉴定亲本A和B都感玉米丝黑穗病。
[0064] 2、表达载体的转化
[0065] 将上述制备得到的表达载体P1300-WAK转化到农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导 法将表达载体转化入感丝黑穗病玉米材料HiII的幼胚中，利用潮霉素对转化阳性愈伤进 行筛选，最后得到转基因阳性植株。同时设置转空载体对照。
[0066] 3、转ZmWAK基因玉米的鉴定
[0067] 使用分子标记gen〇WAK2对转基因后代进行鉴定
[0068] 取玉米幼苗时期的实验组和对照组植株叶片，提取待测植株基因组DNA，以该基因 组DNA为模板，以CldH2O为空白对照，未转染表达载体的玉米材料HiII基因组DNA为阴性 对照，表达载体质粒为阳性对照，PCR扩增时所用引物序列为：
[0069]genoWAK2F:5, -TTAAGGCCTAGGCAACGCTC-3,；
[0070]genoWAk2R:5，-GCGTGAGCCTATCTAGCGAC-3，。
[0071] 上述genoWAK2F的核酸序列见序列表中SEQIDNs:4所示；genoWAk2R的核酸序列 见序列表中SEQIDNs:5所示。上述genoWAK2F和genoWAk2R组成的引物对是根据ZmWAK 基因编码链的反向互补链设计的。
[0072] 将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测结果显示，上述选取的实验组植 株和表达载体质粒阳性对照组中均可以检测到约446bp的条带，而CldH2O空白对照和未转 染表达载体的玉米材料HiII阴性对照组中均未检测到相应的DNA分子片段，说明ZmWAK基 因已整合到上述实验组玉米材料HiII的基因组中。
[0073](三)、转ZmWAK基因玉米的表型
[0074] 将上述鉴定为阳性的Ttl代转基因植株进行自交得到T1代。将T1代阳性植株与高 感丝黑穗病自交系Huangza〇4进行杂交得到T1F1后代。对T1F1代进行自交得T1F2代；T1F1 代与高感丝黑穗病自交系回交得BC1T1Fiq
[0075] 使用分子标记gen〇WAK2对T1Fp I\F2、BC1T1F1代植株进行基因型鉴定。鉴定过程 同本实施例中转ZmWAK基因玉米的鉴定过程一样，不同的是将上述实验组和对照组植物更 换为T1Fp T1F2JC1T1F1代植株。
[0076] 使用分子标记gen〇WAK2进行基因型鉴定的部分结果见图1所示。图1中，M表示 2-kbmarker，泳道1的模板为表达载体质粒，泳道2的模板为亲本A的基因组DNA，泳道 3的模板为亲本B的基因组DNA，泳道4为CldH2O空白对照，泳道5-16的模板为#17-2转 基因事件Tl代阳性植株。
[0077] 按照基因型鉴定结果将后代分为两种类型：
[0078] 将可检测到446bp条带的植株定义为带有转ZmWAK基因插入片段的后代，根据检 测结果，属于此类型的植株包括：# 17-2、#9-21的T1F1代植株、植株# 17-2的T1F2代和BC1T1F1 代植株含有转基因插入片段的分离后代单株；
[0079] 将未检测到446bp条带的植株定义为不带转基因插入片段的后代，根据检测结 果，属于此类型的植株包括：#17-2、#9-21的T1F1代植株、植株#17-2的T1F2代和BC1T1F1代 植株不带转基因片段的同胞分离后代单株。
[0080] 对上述两种类型的后代进行表型鉴定。对于玉米丝黑穗病，单株表型鉴定准确，具 体鉴定标准为：将玉米雌雄穗含有黑粉孢子或是表现出畸形生长的植株定为感病，所有表 现正常的植株为抗病。然后对上述两种类型的后代进行的抗病率进行统计，最后计算两种 类型的后代在抗病率上是否存在显著差异，以鉴定基因的功能。同时设置转空载体对照。
[0081] 表型鉴定过程：取上一年病株的病缨，收集黑粉孢子避光通风贮藏，作为来年的接 种源。将需要鉴定的玉米种子播种于育苗盘中，种子上覆盖含有1%。黑粉孢子的土壤进行人 工接种。在育苗盘中接种生长一个月后，将接种的幼苗移栽入地里继续生长发育。在玉米 乳熟期进行性状鉴定。鉴定时观察玉米的雌穗和雄穗是否出现典型症状，必要时需要将雌 穗的苞叶剥开，观察内部是否存在黑粉病缨。
[0082] 表型鉴定结果见图2。图2结果显示#17-2的分离后代BC1T1F1代中，带有转基因 的插入片段的单株（见图2中标记为转基因的植株），其雌穗表现正常，能够顺利吐丝授粉。 而分离后代BC1T1F1代中不带有转基因插入片段的单株(见图2中标记为非转基因的植株)， 其雌穗被病菌的黑粉孢子取代，不能正常吐丝授粉。转空载体对照的表型与图2中标记为 非转基因的植株的表型一致。
[0083] 抗病率统计结果见图3。图3结果显示，两个转基因事件#17-2和#9-21的T1代 转基因阳性植株与黄早四杂交的分离后代T1F1代中带有转ZmWAK基因插入片段的植株(见 图3A中标记为转基因的统计结果，**表示p〈0. 01)，以及植株#17-2的T1F1代中转基因阳 性植株与黄早四杂交的BC1T1F1代植株(见图3B中标记为转基因的统计结果，*表示p〈0. 05) 和自交后代T1F2代植株(见图3C中标记为转基因的统计结果，**表示p〈0. 01)中带有转 ZmWAK基因插入片段的植株，其丝黑穗抗性显著高于其同世代中不带有转ZmWAK基因插入 片段的同胞植株(见图3A-C中标记为非转基因的统计结果)。
[0084] 上述实验结果表明，玉米基因ZmWAK可显著增强玉米对丝轴黑粉菌的抗性，可用 于制备高抗丝黑穗病玉米。
【权利要求】
1. 一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白： 1) 序列表中的SEQ ID Ns. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2) 将序列表中的SEQ ID Ns . 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与植物抗丝黑穗病相关的由1)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列 之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns :1第70-2259位的核苷酸序列； 2) 编码序列表中SEQ ID Ns :2蛋白质序列的多核苷酸序列； 3) 序列表中SEQ ID Ns :3所示的核苷酸序列； 4) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Ns:l或SEQ ID Ns:3限定的DNA序列杂交 的核苷酸序列； 5) 与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以 上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
4. 含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌； 所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体具体为在出 发载体PCAMBIA1300的多克隆位点插入具有SEQ ID N2:3所示核酸序列的DNA片段所得的 质粒。
6. 扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
7. 权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在增强植物抗丝黑穗病中的应用； 或，在培育转基因植物中的应用；所述转基因植物与所述目的植物相比，所述转基因植 物对丝黑穗病的抗性增强。
8. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2-3任一所述的编码基因或权利要求4 所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌导入目的植物，得到转基因植物；所述转 基因植物与所述目的植物相比，所述转基因植物对丝黑穗病的抗性增强。
9. 一种分子标记，为下述1)或2): 1) 一条引物具有序列表中SEQ ID Ns :4所7]^的核昔酸序列，另一条引物具有序列表中 SEQ ID Ns :5所示的核苷酸序列； 2) -条引物的核酸序列为序列表中SEQ ID Ns :4所示的核苷酸序列的反向互补序列， 另一条引物的核酸序列为序列表中SEQ ID N2:5所示的核苷酸序列的反向互补序列。
10. 权利要求9所述的分子标记物在鉴定和/或检测权利要求2或3所述编码基因或 待测植物是否抗丝黑穗病中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK104341494SQ201310346549
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】徐明良, 左为亮, 谭国庆, 晁青, 陈永胜, 赵贤容, 张楠, 邢跃先, 魏莱, 赵晶, 张博琦, 夏远峰 申请人:中国农业大学