一种猪gapdh蛋白抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪GAPDH抗体及其制备方法与应用。本发明通过表达纯化猪的GAPDH蛋白，制备免疫原，免疫纯种新西兰兔，制备兔抗猪GAPDH蛋白的抗体，弥补了猪特异性抗体缺乏的空白，为猪遗传育种科学研究提供了材料；而且本发明制备的抗猪的GAPDH抗体能够很好的识别猪和鼠的GAPDH蛋白；而市场上购买的抗人的GAPDH抗体仅能够有限的识别鼠的GAPDH蛋白，对猪的GAPDH蛋白基本不能识别。
【专利说明】—种猪GAPDH蛋白抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程【技术领域】，具体涉及一种猪GAPDH蛋白抗体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]目前国内外针对猪的抗体制备非常稀少，而随着猪分子遗传育种工作的深入开展，对猪特异性抗体的需求愈加强烈。在以猪为实验材料的研究中，经常会遇到检测某一蛋白的表达时找不到合适的抗体的情况，使得许多研究无法全面的展开。因此，制备猪的蛋白抗体十分紧迫。
[0003]GAPDH基因是一种非常重要的内参基因，在mRNA和蛋白检测中作为标准广泛应用。GAPDH抗体在人和小鼠身上都已经有了很成熟的研究，如谭翔文等(2008)曾克隆了人的GAPDH基因的部分片段，构建了重组质粒pUC18-GAPDH，且小鼠的GAPDH单克隆抗体已经开始了商业化生产，但是猪GAPDH抗体却极度缺乏。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术中猪抗体资源的不足，提供一种猪GAPDH蛋白抗体；弥补了猪特异性抗体缺乏的空白，为猪遗传育种科学研究提供了材料。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种猪GAPDH蛋白抗体的制备方法。
[0006]本发明的另一个目的是提供一种猪GAPDH蛋白抗体的应用。
[0007]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种猪GAPDH蛋白抗体，以猪的GAPDH蛋白作为抗原免疫动物，分离动物抗血清，纯化得到猪GAPDH蛋白抗体。
[0008]一种猪GAPDH蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤:
51.克隆得到猪GAPDH基因，将猪GAPDH基因进行原核表达得到猪GAPDH蛋白；
52.将猪GAPDH蛋白与等剂量的免疫佐剂均匀混合，制成免疫原，皮下注射纯种新西兰兔，经过四次免疫后，收集兔血清，通过蛋白A琼脂糖凝胶纯化获得GAPDH抗体。
[0009]步骤S2所述免疫原的制备方法为:将400μ?纯化的猪GAPDH蛋白和600μ? PBS溶液和ImL完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂相互混合，搅拌20min混匀后得到的白色油乳剂即为免疫原。
[0010] 步骤SI原核表达时，确定IPTG诱导浓度为0.0lmM，诱导时间为5小时。
[0011]如上所述猪GAPDH蛋白抗体的应用，所述猪GAPDH蛋白抗体能够高效特异识别猪GAPDH蛋白，应用于通过ELISA、Western blot检测猪相关蛋白的表达情况。
[0012]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
(I)本发明首次用猪GAPDH蛋白为抗原，制备GAPDH抗体。目前市场上GAPDH抗体主要是以人或鼠源GAPDH蛋白制备，而本发明制备的GAPDH抗体能够更特异的识别猪GAPDH蛋白，在以猪为研究对象的科学研究中具有广泛的应用前景。[0013](2)通过检测试验发现，本发明制备的GAPDH抗体效价达到1:4000，能够很好的应
用于科学研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1.本发明兔抗猪GAPDH抗体制备流程图。
[0015]图2.猪GAPDH基因PCR产物电泳结果；M.DNA marker ; I~4为以猪肌肉cDNA为模板的PCR扩增产物；5.阴性对照。
[0016]图3.含有PMD18-T-GAPDH重组质粒的阳性候选克隆PCR鉴定结果；M.DNAmarker ；1-2为单克隆菌落。
[0017]图4.猪GAPDH蛋白序列信号肽预测结果。
[0018]图5.pET-28a ( + )质粒的双酶切结果，1.完整的pET_28a ( + )质粒作为对照；2.双酶切后的pET_28a ( + )质粒；3.Marker。
[0019]图6.pMD18-T-GAPDH 质粒的双酶切结果；1.Marke ；2.完整的 pMD18_T_GAPDH 质粒；3.双酶切后的pMD18-T-GAPDH质粒。
[0020]图7.重组质粒pET-28a( + )_GAPDH双酶切鉴定结果；M.Marker ；1.双酶切前的质粒；2.双酶切后的质粒。
[0021]图8.不同诱导时间下蛋白表达量检测；M.蛋白Marker ;C.不加IPTG诱导；1~5.加入IPTG诱导后lh，2h，3h，4h，5h的蛋白表达情况。
[0022]图9.不同诱导浓度下蛋白表达量检测；M.蛋白Marker ;C.不加IPTG对照；1飞.1PTG 浓度依次为 0.01 mM,0.05 mM,0.1 mM,0.5 mM，ImM 的表达产物。
[0023]图10.N1-NTA层析柱纯化GAPDH蛋白结果；1.纯化后所得蛋白上清；2.上清与沉淀混合；3.菌液滤液；4.lysis buffer ；5.wash buffer?
[0024]图11.蛋白A琼脂糖凝胶纯化GAPDH抗体结果；M.蛋白Marker ; 1.购买的GAPDH抗体；2.纯化后GAPDH抗体；3.过滤液。
[0025]图12.Elisa检测GAPDH抗体效价。
[0026]图13.Westernblot检测GAPDH抗体，I~5泳道均为GAPDH抗原蛋白。
[0027]图14.本发明所述抗猪GAPDH的抗体与市售抗人GAPDH的抗体的特异性比较;A.抗猪GAPDH的抗体；B.抗人GAPDH的抗体；PSCs为猪骨骼肌卫星细胞；C2C12为鼠成肌细胞。
【具体实施方式】[0028]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0029]实施例1
S1.克隆猪GAPDH基因:本发明中，首先提取猪骨骼肌卫星细胞总RNA，反转录得到cDNA，以此为模板克隆得到猪GAPDH基因。
[0030]Sll.猪总骨骼肌卫星细胞总RNA的提取参照TAKARA公司的RNAiso Plus总RNA提取试剂使用说明书。
[0031]S12.总RNA的反转录:RNA的反转录参照TIANGEN公司的TIANScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下:
在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物:
【权利要求】
1.一种猪GAPDH蛋白抗体，其特征在于，以猪的GAPDH蛋白作为抗原免疫动物，分离动物抗血清，纯化得到猪GAPDH蛋白抗体。
2.权利要求1所述猪GAPDH蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.克隆得到猪GAPDH基因，将猪GAPDH基因进行原核表达得到猪GAPDH蛋白； 52.将猪GAPDH蛋白与等剂量的免疫佐剂均匀混合，制成免疫原，皮下注射纯种新西兰兔，经过四次免疫后，收集兔血清，通过蛋白A琼脂糖凝胶纯化获得GAPDH抗体。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述免疫原的制备方法为:将400μ?纯化的猪GAPDH蛋白和600μ? PBS溶液和ImL完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂相互混合，搅拌20min混匀后得到的白色油乳剂即为免疫原。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤SI原核表达时，确定IPTG诱导浓度为0.0lmM，诱导时间为5小时。
5.权利要求1所述猪GAPDH蛋白抗体的应用，其特征在于，所述猪GAPDH蛋白抗体能够高效特异识别猪GAPDH蛋白 ，应用于通过ELISA、WeStern blot检测猪相关蛋白的表达情况。
【文档编号】C07K16/18GK103450358SQ201310349356
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】王翀, 徐建, 田志浩, 区锦馨, 曾芳, 童雄, 李加琪, 吴珍芳, 张哲
申请人:华南农业大学