专利名称：抗α6整合蛋白抗体的制作方法
侵入的癌细胞在血管内皮上的粘连，是转移过程中关键性的第一步，也是具有选择性的一步。在过去的几年中，已发现大量的不同粘连分子参与造血细胞的细胞迁移和返巢机理。转化的肿瘤细胞能以某种不受控制的方式明显误用这种机理，从而导致在不同于其原来所在组织的组织中发生转移。
本发明的单克隆抗体具有抑制转移的特异能力，在这一基础上现已意外地发现，另一种称为α6整合蛋白(integrin)的分子(综述见Hemler，Annu.Rev.Immunol.8∶365-400，1990)，即这些单克隆抗体所识别的抗原，也可被认为是参与转移过程的内皮粘连分子，而且可能是最重要的内皮粘连分子。
文献中已描述了针对α6整合蛋白链的三种其他抗体，它们的生产方法完全不同。抗体GoH3是通过用血小板免疫大鼠而产生的。选择这种抗体是因为它识别血小板蛋白复合物Ⅰc-Ⅱa，该复合物后来被定义为α6/β1整合蛋白(Sonnenberg等，J.Biol.Chem.26210376-10383，1987;Hemler等，J.Biol.Chem.2637660-7665，1988)。抗体135-13C是在大鼠体内针对纯化的肿瘤联结蛋白TSP-180制备的，该抗体现在被称作α6/β4整合蛋白(Kennel等，Cancer Res.413465-3470，1981;Kennel等，J.Biol.Chem.26415515-15521，1989)。最后，抗体GB36是在小鼠体内针对人胎盘微绒毛制备物而生产的。该抗体识别人癌细胞上的细胞表面蛋白(Hsi等，Placenta 8209-217，1987)。现已有人提出，所识别的蛋白(α6/β1整合蛋白)可能对维持细胞极性有作用，但尚未进行功能测定。
癌、黑素瘤和内皮细胞能够与细胞外基质分子昆布氨酸粘连。包括α1/β1和α2/β1和α6/β1在内的几种整合蛋白复合物，参与介导这种结合作用。其中的一种整合蛋白即α6/β1，似乎能与昆布氨酸发生单特异性反应，而抗体GoH3则能阻断细胞-昆布氨酸相互作用，该抗体将α6整合蛋白确定为由弹性蛋白酶消化产物得到的E8片段的受体(Sonnenberg等，1990)。抗体135-13C也对细胞与昆布氨酸的结合有影响，但程度较低。
本发明的抗体不干扰细胞与昆布氨酸的结合，但却阻断黑素瘤细胞与血管内皮细胞的细胞间相互作用。这一发现强烈提示，本发明的抗体识别α6整合蛋白链上的一个迄今为止尚属未知的结构域，这个结构域明显不同于GoH3、135-13C或GB36的结合位点。这可由如下事实进一步证实，即，GoH3与绵羊的皮肤返巢淋巴细胞发生交叉反应，而本发明的抗体则不然。
因此，本发明的一个目的是提供一种单克隆抗体或其功能衍生物，尤其是Fab片段，其特征在于它能与哺乳动物(例如小鼠，优选人)的α6整合蛋白结合(抗α6整合蛋白单克隆抗体)，该抗体抑制转化细胞的转移，尤其是通过抑制转化细胞与血管内皮的相互作用。一般来说，这类转化细胞一方面是以带有α6整合蛋白作为表面分子为特征的细胞，例如黑素瘤、癌、T细胞淋巴瘤或肉瘤，优选黑素瘤和癌，尤其是黑素瘤;另一方面是带有迄今未确定的α6整合蛋白配体作为表面分子的细胞。
本发明的另一个目的是，提供分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系，以及由这些细胞系分泌的单克隆抗体。按本发明所述获得的杂交瘤细胞系“F3C34”已保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)。本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体或其片段作为治疗剂，尤其是用于通过抑制转移而治疗癌症。
与α6整合蛋白结合的抗体可以用某些短肽作起始抗原来制备，这些短肽的氨基酸顺序是由人α6整合蛋白的已知氨基酸顺序衍生的(Hogervorst等，Eurp.J.Biochem.199425-433，1991)。这些肽可以用肽和蛋白质化学合成领域内已知的方法来制备，例如用如Gross和Meyenhofer("The Peptide"，Vols.1-9，Academic Press，Inc.，Harcourt Brace Jovanovich，Publs.，San Diego，1979-1987)或Fields和Nobel(Int.J.Pept.Prot.Res.35161-214，1990)所述的部分或完全液相或固相合成法。
然而，以这样一种方式制备的抗体并不一定与天然α6整合蛋白反应，也不一定具有本发明抗体的特定性质。所以，本发明的抗体可以由α6整合蛋白阳性细胞起始来制备，例如内皮细胞或内皮细胞来源的转化细胞，其中特别优选的是一种eEnd2细胞系。
给非人类哺乳动物如小鼠、家兔、大鼠或绵羊注射上述抗原，就能用本领域已知的方法从血清中得到多克隆抗体。可以用以下方法制备单克隆抗体由上述免疫动物回收抗体生成细胞，并以常规方式使得到的所述细胞永久化，例如与骨髓瘤细胞(如PAI小鼠骨髓瘤细胞、SP2/0细胞或SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581;ATCC CRL8287))融合(关于抗体生产方法的一般性指导，参见例如冷泉港实验室的Harlow，E.和Lane，D.所编的《抗体-实验室手册》一书，冷泉港实验室出版社，1988)，或者如实施例Ⅰ所详述的那样制备单克隆抗体。
接着，必须用某种测定法筛选出分泌本发明抗体的杂交瘤培养上清液，这种测定法测定的是本发明抗体的转移抑制性质，例如如实施例Ⅰ所详述的测定法。所以，本发明的又一个目的是，提供一种按本领域已知方法制备抗α6整合蛋白单克隆抗体及其片段的方法以及用这样一种方法制得的化合物，所述方法中，借助所述上清液中所含的抗体抑制转移的能力对所得的杂交瘤上清液进行筛选。
可以用常规色谱法从杂交瘤上清液中纯化出抗α6整合蛋白单克隆抗体，例如象离子交换色谱、G蛋白亲和色谱、与固相载体结合的抗免疫球蛋白抗体或抗原或其一部分、HPLC等。
为了按本领域公知的方法生产大量的抗α6整合蛋白单克隆抗体，可以给小鼠腹膜内注射分泌所需抗体的杂交瘤，小鼠在注射前已预先用(例如)朴日斯烷处理。这种腹水瘤在一只小鼠体内最多可产生100mg左右的单克隆抗体。可以用上述方法从腹水瘤所产生的腹水中纯化出抗体。
本发明的抗体可以用已知方法按其亚型来鉴定，例如用乌赫特朗尼氏免疫扩散法。杂交瘤细胞系“F3C34”所分泌的抗体为IgG2a亚型。另外，本发明的抗体可以借助它们抑制转化细胞转移，尤其是抑制转化细胞与血管内皮相互作用的能力得到鉴定。这种活性可用本领域已知的测定法来测定，例如，在体外用实施例Ⅰ所述的测定法，或者在体内用实施例Ⅱ所述的测定法，在这些测定法中，可以根据转化细胞和本发明抗体能够与之结合的适宜组织材料(体外测定的情况)，以及转化细胞系在其体内诱发转移且本发明抗体能与其交叉反应的动物的类型，使用任何带有α6整合蛋白作为表面分子的转化细胞系，例如黑素瘤，如B16细胞(Vollmers等，Cell 40547-557，1985);癌，如KLN205(ATCC CRL1453)或CMT-93(ATCC CCL223)或MM45T(ATCC CRL6420);T细胞淋巴瘤，如BW5147(ATCC TIB48);或者肉瘤，如MM46T(ATCC CRL6420);这种转化细胞系与血管内皮相互作用的抑制，可以用本领域已知的测定法来测定，例如在单层内皮细胞或内皮来源的细胞上进行体外粘连测定，或者如实施例Ⅰ所述和图2所示进行测定，图2中，箭头清楚地指向与血管内皮结合的转化细胞的位置。最后，本发明的抗体可以通过在如实施例Ⅴ所述的测定中阻断细胞迁移来鉴定，或者通过在如实施例Ⅵ所述的测定中不影响细胞生长来鉴定。
另外，正如在人内皮细胞顶表面上检测α6整合蛋白所证实的，本发明的抗体能与人α6整合蛋白交叉反应(参见例如实施例Ⅲ)，这种检测与小鼠α6整合蛋白在小鼠血管内皮顶表面上的体内染色相关(参见实施例Ⅳ)。
抗α6整合蛋白单克隆抗体可以象本领域所已知的那样进行修饰以供各种不同用途，也可以如实施例Ⅱ所述制得这些抗体的仍具有抗原结合作用的片段(Harlow和Lane，同上)。例如，可以用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等对抗体进行酶解而制得片段。此外，本发明的抗体可以象本领域所已知的那样，如美国专利4，179，337所述加入聚乙二醇亚单位进行修饰，也可以使抗体与荧光染料、生色物质如酶(酶联免疫吸附测定，ELISA)、或放射性物质(放射免疫测定，RIA)偶联，偶联方法是本领域公知的，并象本领域所已知的那样用于这些测定体系。另外，这些抗体可以按照本领域已知的方法进行“人化”，例如国际专利申请公开WO 90/7861中所公开的用于特异于人白细胞介素2受体亚基的抗体的方法，因此，上述的功能衍生物也是本发明的目的。
本发明的单克隆抗体也可以作为治疗剂使用，尤其是用于治疗癌症，例如通过抑制转移治疗癌症，在手术过程中发生继发性转移的情况下尤其如此。
如果需要，这些抗体可以和其他药物活性物质配伍而与常用的可药用固体或液体载体物质混合使用，其他药物活性物质优选单克隆抗体或肽，它们针对不同的粘连分子，这些粘连分子都应存在于血管内皮或转移细胞上。剂量和单位剂量可以类似于目前用于各种疾病临床治疗的抗体的剂量和单位剂量加以选择。
因此，本发明的又一个目的是提供可临床使用的抗α6整合蛋白单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，该组合物含有一种或更多种抗α6整合蛋白单克隆抗体或其片段，需要时与其他药物活性物质和/或治疗上可配伍的无毒惰性载体物质配伍。这些药物组合物可以按本领域技术人员所熟悉的方法来制备。
另外，本发明的单克隆抗体可以用作疾病尤其是癌症的诊断标记。本领域公知，就这类目的而言，可以使单克隆抗体与荧光染料、生色物质如酶(酶联免疫吸附测定，ELISA)、或放射性物质(放射免疫测定，RIA)偶联，偶联方法是本领域公知的，并象本领域所已知的那样用于这类测定体系，如Harlow和Lane(同上)所述。
下列实施例说明本发明，但不限制本发明。
实施例Ⅰ抗α6整合蛋白单克隆抗体的制备从150cm2培养瓶中取汇合内皮细胞(eEnd2细胞系)，以10，000拉德进行照射，并用细胞刮刀(Costar Data Packaging)收集细胞。然后将这些细胞用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco BRL)洗涤，按1∶1与完全弗氏佐剂混合，使终体积达300μl，用此悬浮液给2月龄PVG大鼠(BRL，Füllinsdorf，CH)后足的背面进行皮下注射。7天和14天后重复只用细胞的DPBS悬浮液进行的注射。第17天从大鼠体内剖出引流腘淋巴结。将该组织用下列酶贮液酶解150mg/ml Ⅸ型蛋白酶(P-6141;Sigma Chemical Co.，Buchs，CH);8mg/ml胶原酶CLS4(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ，USA);10mg/ml DNA酶Ⅰ(Sigma Chemical Co.)。混合酶溶液使终体积为2ml(0.5ml胶原酶、0.1ml蛋白酶、0.1ml DNA酶、1.3ml IMDM(Iscoves改良型MEM;Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA))。用25号针头做两个小横切口，打开一个淋巴结。然后将基质于37℃下消化两次，每次用1ml酶混合液消化30分钟。然后用巴氏吸管将细胞小心地释放到IMDM中，在50ml IMDM中洗涤，然后计数。然后如Harlow和Lane(1988)所述，将1份淋巴结细胞与5份小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞(ATCC CRL1581)混合，离心，用PEG 4000(E.Merck，Darmstadt，FRG)进行融合。然后将细胞(100μl，在IMDM选择培养基中)以5×104个细胞/孔的密度涂布在微量滴定板(96孔，Costar Data Packaging)中的条件培养基中，选择培养基中含有HAT(Gibco BRL)、10%胎牛血清(FCS，Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，FRG)、50μMβ-巯基乙醇、青霉素/链霉素、谷氨酰胺。条件培养基是在融合前在选择培养基中将104个PVG大鼠胸腺细胞(100μl/孔)培养3天而制得的。
根据是否阻断B16/129黑素瘤细胞与小鼠肺或肝组织冷冻切片的结合，筛选出含转移抑制性单克隆抗体的杂交瘤上清液。
在新制备的成年小鼠组织冷冻切片上进行原位结合(Woodruff等，Annu.Rev.Immunol.5∶201-222，1987)。将器官包埋并冷冻在Tissue-Tek，O.C.T.Compound(Miles Inc.，Elkhart，IN，USA)中，切成5μm厚，并封固在玻璃载片上。用PapPen(SCI Science Services，Munich，FRG)画下切片的轮廓，然后立即把切片放入含1%牛血清清蛋白(BSA)的DPBS中至少10分钟。将载片上用PapPen标出的区域附近干燥，然后在组织切片上加105个悬浮在200μlDPBS中的B16黑素瘤细胞，该DPBS中含有20%如上所述制备的杂交瘤培养上清液或一种对照抗体(大鼠IgG，得自Jackson Immuno Research Lab)。使结合反应在50rpm的小型摇床(Kuhner，Basel，CH)上于8℃下进行40分钟。然后把载片垂直放入含0.5%戊二醛和2%甲醛的DPBS中，从而使未结合的细胞脱落。在室温下固定20分钟并在含20%乙醇的0.25%乙酸硫堇中复染后，用ZeissAxiophot光学显微镜计数与所研究的组织切片结合的B16细胞。
图1给出了肺和肝组织切片以及按与上述肺和肝同样的方式制备的其他组织切片(肾、胸腺、脾和心脏)的结果，其中左栏给出的是在没有抗α6整合蛋白单克隆抗体的条件下与所示组织结合的B16细胞的平均数，右栏给出的是在含有抗α6整合蛋白单克隆抗体的杂交瘤上清液存在下的平均数。图2显示了与对照上清液(a)或含有抗α6整合蛋白单克隆抗体的杂交瘤上清液(b)一起保温的肺组织切片，以及与对照上清液(c)或含有抗α6整合蛋白单克隆抗体的杂交瘤上清液(d)一起保温的肝组织切片。
用如上所述制备的抗体进行免疫沉淀，并对所沉淀出的抗原进行部分N末端顺序测定，表明该抗体是针对小鼠α6整合蛋白的，因为所测出的头15个氨基酸的顺序除14位(丝氨酸而非酪氨酸)外均与人α6整合蛋白的顺序相同。
实施例Ⅱ抗α6整合蛋白单克隆抗体的体内鉴定将得自B16-F10小鼠黑素瘤细胞的一个亚系(第3代)即B16-129细胞(Vollmers等，1985)解冻，在含有10%胎牛血清(FCS)(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，FRG)的DMEM(Gibco，BRL，Paisley，UK)中最多传代培养2-3次，用胰酶迅速消化，用完全培养基洗涤，并重新悬浮于PBS中。静脉注射1.5×105个细胞10天后造成每肺300-500处损害，注射7.5×104个细胞则造成30-50处损害。
为在体内鉴定抗α6整合蛋白单克隆抗体，将B16-129细胞与对照大鼠单克隆抗体或抗α6整合蛋白单克隆抗体或其Fab片段一起给小鼠静脉注射。10天后计数肺B16-129集落。结果示于表Ⅰ和表Ⅱ。
关于表Ⅰ，每组10只小鼠，每只小鼠注射7.5×104个细胞。关于表Ⅱ，给小鼠注射1.5×105个B16-129细胞(a)细胞与抗体同时注射;(b)在注射细胞24小时前注射抗体;(c)将黑素瘤细胞与抗体一起保温60分钟，洗涤后给动物注射。该表代表所做的三个实验之一，每组注射5只小鼠。
表Ⅰ
单克隆抗体／小鼠 单克隆抗体Fab/小鼠 单克隆抗体Fab/小鼠每只小鼠的37(5－113) 1(0－4) 00肺损害表Ⅱ处理类型对照 抗α6整合蛋白 肺损害降低率单克隆抗体的Fab同时注射(a) 610(321-993) 147(3-481) 86%小鼠预处理(b) 742(321-1025) 474(45-1008) 36%B16－129黑素瘤预处理(C) 465(208-563) 224(145-253) 62%处理类型 对照 抗α6整合蛋白 肺损害降低率单克隆抗体的Fab同时注射(a) 610(321-993) 147(3-481) 86%小鼠预处理(b) 742(321-1025) 474(45-1008) 36%B16-129黑素瘤预处理(c) 465(208-563) 224(145-253) 62%用G蛋白亲和柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)从杂交瘤上清液中纯化抗α6整合蛋白单克隆抗体。用试剂盒"AvidChrom"(BioProbe International，Tustin，CA，USA)制备其Fab片段。作对照使用的是正常大鼠IgG(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA，USA)。
实施例Ⅲ抗α6整合蛋白单克隆抗体与人内皮细胞的结合用以下方法证明抗α6整合蛋白单克隆抗体在人内皮细胞顶表面上的结合作用。象本领域所已知的那样将HUV-EC-C细胞(ATCC CRL1730)培养至汇合，用甲醛固定法使其稳定，并与100μg/ml抗α6整合蛋白单克隆抗体贮液的逐级稀释液一起保温，先用生物素化的小鼠抗大鼠抗体(Jackson Immuno Research，West Grove，PA，USA)，然后用与过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素及2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)即ABTS(Sigma)检测表面结合抗体，ABTS是可在405nm读数的底物。结果示于图3。
实施例Ⅳ体内血管表面染色在C57B1/6小鼠(IFFAC-CREDO，Lyon，F)尾静脉内注射1mg经过G蛋白-Sepharose纯化的抗α6整合蛋白单克隆抗体。注射4小时后将动物处死，将组织包埋在Tissue-Tek(Miles Inc.，Elkart，IN46515，USA)中，用恒冷切片机切片，并准备用FITC结合的羊抗大鼠IgG抗体(Jackson Immuno Research，West Grove，PA，USA)进行免疫荧光染色。图4(a)显示了肺的相差显微镜照片，图4(b)显示了肺的免疫荧光染色。图4(c)显示了肝的相差显微镜照片，图4(d)显示了肝的免疫荧光染色。注射1mg大鼠IgG对照没有显示出任何信号。
实施例Ⅴ细胞迁移的阻断在12孔组合培养皿(Costar)中，在含有0.3%、3%或10%胎牛血清的培养基中，将B16-129黑素瘤细胞涂布至汇合。然后用蓝色吸管头(Gibco BRL，Gaithersburg MD，USA)在培养皿上画痕，造成细胞单层的创伤，从而留下一个明确分开的无细胞区。再培养24小时后，观察细胞向此区内的迁移。细胞在3%或10%血清中培养时对细胞迁移没有影响(未给出结果)，但在0.3%血清中培养时，抗α6整合蛋白单克隆抗体强烈阻断B16-129细胞的迁移。图5(a)和图5(b)分别显示了在30μg/ml对照大鼠IgG和30μg/ml抗α6整合蛋白单克隆抗体存在下，0.3%血清中的细胞向创伤区中部的迁移。
实施例Ⅵ对细胞生长的影响以每孔104个细胞的密度，将B16-129黑素瘤细胞涂布在24孔组合培养皿(3524，Costar，Cambridge，MA，USA)中的含0.3%、3%或10%胎牛血清的培养基中，培养基中加有30μg/ml抗α6整合蛋白单克隆抗体(A)或作为对照的30μg/ml大鼠IgG单克隆抗体(B)。在4天内，每个条件取两孔的细胞进行胰酶消化和计数。细胞在10%和3%血清中很容易生长，但在0.3%血清中，在所测试的4天内都保持平静。在这两个条件下，抗α6整合蛋白单克隆抗体对细胞生长都没有任何影响。结果示于图6，其中实心方块代表0.3%胎牛血清和(B)，实心圆代表0.3%胎牛血清和A，空心方块代表3%胎牛血清和(B)，空心三角代表3%胎牛血清和(A)，实心三角代表10%胎牛血清和(B)，空心圆代表10%胎牛血清和(A)。
权利要求
1.一种制备单克隆抗体或其功能衍生物的方法，该单克隆抗体或其功能衍生物的特征是具有与哺乳动物α6整合蛋白结合和抑制转移的能力，该方法的特征在于，给非人类哺乳动物注射α6整合蛋白阳性细胞作为起始抗原，由该免疫动物回收抗体生成细胞并以常规方式永久化，用测定转移抑制作用的测定法筛选所得的杂交瘤细胞系，从相应杂交瘤细胞系的上清液中分离所分泌的抗体，需要时用酶法或化学法进行水解。
2.如权利要求1所述的方法，其中哺乳动物α6整合蛋白为人α6整合蛋白。
3.一种制备杂交瘤细胞系的方法，该细胞系分泌可由如权利要求1或2所述的方法制得的单克隆抗体，该方法的特征在于，给非人类哺乳动物注射α6整合蛋白阳性细胞作为起始抗原，从该免疫动物回收抗体生成细胞并以常规方式永久化，用测定转移抑制作用的测定法筛选所得的杂交瘤细胞系。
4.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，使由如权利要求1或2所述的方法制得的化合物和(需要时)其他药物活性物质，与治疗上可配伍的无毒惰性载体物质混合，并将该混合物制成格林制剂使用形式。
5.一种药物组合物，该组合物含有一种或更多种按如权利要求1或2所述方法制得的化合物，需要时与其他药物活性物质和/或治疗上可配伍的无毒惰性载体物质配伍。
6.按权利要求1或2所述方法制得的化合物在制备权利要求5的药物组合物中的应用。
7.一种单克隆抗体或其功能衍生物，其特征在于，无论何时由权利要求1或2所述的方法制得，它都具有与哺乳动物α6整合蛋白结合和抑制转移的能力。
8.如上所述的发明。
9.一种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体可由如权利要求1或2所述的方法制得。
全文摘要
本发明涉及一种单克隆抗体或其片段，其特征在于，它具有与哺乳动物α6整合蛋白(优选人α6整合蛋白)结合和抑制转移的能力。本发明还涉及一种分泌上述抗体的杂交瘤细胞系，制备该杂交瘤细胞系和抗体的方法，含有该抗体或其片段的药物组合物，以及该抗体或其片段在治疗疾病尤其是癌症中的应用。
文档编号C07K16/00GK1072687SQ92111620
公开日1993年6月2日 申请日期1992年10月17日 优先权日1991年10月18日
发明者B·A·因姆霍夫 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司