抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体的制作方法

专利名称：抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括抗副甲状腺激素相关蛋白的鼠单克隆抗体可变区(V区)和人抗体恒定区(C区)的人/鼠嵌合抗体，抗副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)的鼠单克隆抗体V区轻链(L链)和重链(H链)的互补决定区移植到人抗体上的人源化抗体，所述抗体的L链和H链，以及含构成所述抗体L链或H链V区的多肽。
本发明还涉及编码上述抗体尤其是其V区的碱基序列的DNA，以及编码V区的L或H链的DNA。本发明进一步涉及含所述DNA的重组载体和所述载体转化的宿主。
另外，本发明涉及制备抗PTHrP嵌合和人源化抗体的方法。并且本发明涉及包括抗PTHrP抗体作为有效成分的高钙血症抑制剂或低磷酸盐血症促进剂的药剂组合物。
背景技术：
与恶性肿瘤有关的高钙血症是在5％到20％的恶性肿瘤病人中发现的严重并发症，它被认为是恶性肿瘤的最终症状，因为如果保留该症状不治疗的话它必然导致死亡。高钙血症的控制极大程度地影响病人的预测和QOL(生命质量)；因此，它将在临床上起重要作用。
通常，恶性肿瘤病人的高钙血症粗略地分为HHM(恶性体液性高钙血症)，其基于产生肿瘤的体液性骨重吸收因子，和LOH(局部溶骨性高钙血症)，其基于转移或渗透到骨的肿瘤的局部活性。HHM中，认为骨吸收或骨硬化被促进从而增加钙的流动并产生高钙血症同时伴随肾钙排泄能力的降低(S.Wada和N.Nagata，国际医学，69，644-648)。
据认为血清钙浓度超过12毫克/dl时表现出高钙血症的症状；因为其症状厌食(食欲不振)，恶心和呕吐在恶性肿瘤病人的早期是非特异性症状。当高钙血症恶化，由于肾小管远侧的损伤造成水浓缩能力的降低导致多尿，厌食的恶心并伴随由于水摄入缺乏导致的脱水。
Moseley，J.M.等发现类似副甲状腺激素(PTH)的物质副甲状腺激素相关蛋白(此后用作“PTHrP”)是一类与恶性肿瘤有关的高钙血症中导致HHM的体液因子美国国家科学院年报(1987)84，5048-5052。
因此，分离了编码PTHrP的基因(Suva，L.J.等，科学(1987)237，893)，并且该分析说明了由于基因的交替拼接产生具有139、141和173个氨基酸的三种人PTHrP，这是由于具有完全结构的PTHrP(1-139)的限制性降解各种片段都出现在血液中Baba，H.，临床钙(1995)5，229-223。PTHrP中，N末端13个氨基酸中的8个氨基酸与PTH的相应部位等同，推测其14到34位的氨基酸位点也与PTH类似具有立体结构；因此，PTHrP和PTH至少在N末端区与共同的PTH/PTHrP受体结合Jueppner，H.等，科学(1991)254，1024-1026；Abou-Samra，A-B.等，美国国家科学院年报(1992)89，2732-2736。
有报道大量肿瘤组织产生PTHrP，还曾阐述不仅在肿瘤中，胎儿以及成人的各种正常组织也产生PTHrP，包括皮肤、中枢神经系统、子宫、胎盘、哺乳期乳腺、甲状腺、副甲状腺、肾上腺、肝、肾和膀胱Burtis，W.J.，临床化学(1992)38，2171-2183；Stewart，A.F.和Broadus，A.E.，临床内分泌学杂志(1991)71，1410-1414。另外，认为PTHrP对胎儿到新生儿期比在母亲中维持更高浓度的钙的代谢调节起重要作用。
目前已知PTH/PTHrP受体主要存在于骨和肾中(C.Shigeno，临床钙(1995)5，355-359)，其通过PTHrP与受体的结合激活多数胞间信号传送系统。其中之一是腺苷酸环化酶，另一个磷脂酶C。腺苷酸环化酶的激活增加了胞间cAMP的浓度从而激活蛋白激酶A。磷脂酶C分解4，5-二磷酸酯酰肌醇产生肌醇1，4，5-三磷酸酯和二酯酰甘油。G蛋白也参与这些信号传送系统Coleman，D.T.等，副甲状腺激素活性的生化机理，“副甲状腺素”(Bilezikian，J.P.等)，Raven Press，NewYork(1994)239页。
通过这些信号传导系统，PTHrP导致HHM中观察到的高钙血症、低磷酸盐血症，肾磷酸盐重吸收能力的降低，肾cAMP排泄的增加等。
因此，曾经阐述PTHrP与恶性肿瘤有关的高钙血症密切相关。治疗恶性肿瘤相关高钙血症时，曾使用降血钙素、类固醇药物、消炎痛、无机磷酸盐、二磷酸盐等，还曾使用体液置换。然而，这些药物连续使用后发现其作用降低，表现出严重副作用，或其药理作用的缓慢表达；因此十分期望使用具有较高治疗作用和较低副作用的试剂或药物。
另一方面，Kukreja，S.C.等报道了一种新的治疗恶性肿瘤相关高钙血症的方法当对人肺或喉癌细胞移植产生高钙血症的无胸腺鼠以抗PTHrP的中和抗血清给药时，血钙浓度和尿cAMP水平降低临床研究杂志(1988)82，1798-1802。Kanji Sato等报道当对移植产生PTHrP的人肿瘤的裸鼠使用抗PTHrP(1-34)抗体给药时，高钙血症缓解，鼠的存活时间显著延长J.Bone & Mine.Res.(1993)8，849-860。另外，日本未审专利申请(公开号为4-228089)公开了抗人PTHrP(1-34)的鼠/人嵌合抗体。
鼠单克隆抗体在人体中具有高度免疫原性(有时也用作“抗原性”)，其限制了鼠单克隆抗体在人体中的药物治疗价值。例如，当给人使用鼠抗体给药时，它可能被作为外源物质代谢掉；因此，鼠抗体在人体中的半衰期相对较短，其期望作用就不能有效表达。另外，抗给药的鼠抗体的人抗鼠抗体(HAMA)可能导致对病人不利和危险的免疫反应，例如血清疾病和其它过敏反应。因此，不能频繁地对人使用鼠单克隆抗体给药。
为了解决这些问题，已经研究出了降低非人来源的抗体，例如，来源于鼠的单克隆抗体的免疫原性的方法。方法之一是制备嵌合抗体，其中可变区(V区)来源于鼠单克隆抗体，恒定区(C区)来源于合适的人抗体。
由于产生的嵌合抗体具有原始鼠抗体的完整可变区，可以认为该嵌合抗体S具有与原始鼠抗体相同的特异性的抗原结合。进一步，这样的嵌合抗体具有的来源于非人动物的氨基酸序列的比例实质上降低；因此，与原始鼠抗体相比，该单克隆抗体同等程度与其抗原结合，而免疫原性降低，但是仍然可能产生对鼠可变区产生一些免疫应答LoBuglio，A.F.等人，美国科学院年报，86，4220-4224，1989。
降低鼠抗体的免疫原性的第二个方法还更复杂，但是预期可进一步大大地降低鼠抗体的潜在免疫原性。这种方法中，仅仅鼠抗体可变区的互补决定区(CDR)移植到人抗体可变区从而产生“改造”的人可变区。如果需要，鼠抗体可变区中支持CDR的框架区(FR)的部分氨基酸序列可以移植到人抗体可变区，以使改造的人可变区CDR结构更接近来原始鼠抗体的类似结构。
然后，这些人源化的改造的人抗体可变区与人恒定区组合。在最后的改造的人源化抗体中，来源于非人氨基酸序列的部分仅仅是CDR以及很少一部分FR。CDR由高度可变氨基酸序列和不表现任何种属特异性的序列组成。因此，包含鼠CDR的人源化抗体将不再显示比含人CDR的天然存在的人抗体更强的免疫原性。
关于人源化抗体，还有如下参考文献Riechmann，L.等，自然，332，323-327，1988；Verhoeye，M.等，科学，239，1534-1536，1988；Kettleborough，C.A.等，蛋白工程，4，773-783，1991；Maeda，H.等，人抗体和杂交瘤，2，124-134，1991；Gorman，S.D.等，美国国家科学院年报，88，4181-4185，1991；Tempest，P.R.等，生物/技术，9，266-271，1991；Co，M.S.等，美国国家科学院年报，88，2869-2873，1991；Carter，P.等，美国国家科学院年报，89，4285-4289，1992；Co，M.S.等，免疫学杂志，148，1149-1154，1992；Sato，K.等，癌症研究，53，851-856，1993。
虽然期望人源化抗体对以前提及的治疗目的有益，但是上述的参考文献中未公开抗PTHrP的人源化抗体，也没有任何建议。另外，在人源化抗体的制备过程中通常没有适用于任何抗体的标准方法；有必要研究特异抗原显示充分结合力和中和活性的人源化抗体的多种手段和方法参见，例如，Sato，K.等，癌症研究，53，851-856，1993。
发明公开本发明的一个目的是提供包含抗PTHrP鼠单克隆抗体可变区(V区)和人抗体恒定区(C区)的人/鼠嵌合抗体，在人源化抗体中抗PTHrP鼠单克隆抗体轻链(L链)和重链(H链)构成的V区的互补决定区移植到人抗体的人源化抗体，所述抗体的L链和H链，以及含所述抗体L链或H链构成的V区的多肽。
本发明的另一个目的是提供含编码上述抗体尤其是其V区的碱基序列的DNA，编码含V区多肽的L或H链的DNA。本发明的再一个目的是提供含所述DNA的重组载体和用所述载体转化的宿主。另外，本发明的目的还在于提供制备抗PTHrP嵌合人源化抗体的方法。本发明的目的还在于提供具有高度中和活性的抗PTHrP抗体。本发明的目的还在于提供一种抗PTHrP的抗体或人源化抗体作为有效成分的药物组合物和高钙血症抑制剂、低磷酸盐血症改善剂、或碱毒症改善剂。
作为综合上述目的后充分研究的结果，本发明人已经成功地获得一种抗PTHrP鼠单克隆抗体，其免疫原性在人体中降低；从而实现了本发明。
本发明涉及含人抗体L链C区和抗PTHrP的鼠单克隆抗体L链V区的嵌合L链。上述L链V区包括如SEQ ID NO45所示的氨基酸序列，L链C区包括Cλ区。
本发明还涉及含人抗体H链C区和抗PTHrP的鼠单克隆抗体H链V区的嵌合H链。上述H链V区包括如SEQ ID NO46所示的氨基酸序列，H链C区包括Cλ1区。
另外，本发明还涉及含所述嵌合L链和所述嵌合H链的抗PTHrP的嵌合单克隆抗体。
并且，本发明还包括含人抗体L链V区的1到4框架区和抗PTHrP的鼠单克隆抗体L链V区的1到3互补决定区的人源化抗体的L链V区的多肽。互补决定区1到3分别为如SEQ ID NO59-61所示的氨基酸序列；框架区1到3分别来源于人抗体HSU03868的1到3框架区，框架区4包括来源于人抗体S25755框架区4；或者框架区1到3包括基本上分别与人抗体HSU03868的框架区1到3相同的序列，框架区4包括基本上与人抗体S25755的框架区4相同的序列。
本文使用的术语“基本上相同”是指人源化抗体中使用的人抗体的框架区具有形成鼠单克隆抗体互补决定区需要的氨基酸缺失、替换和/或添加以使人源化抗体具有与鼠单克隆抗体等同的活性。
因此，本发明涉及含人源化抗体L链V区的多肽，其中框架区的第36和49位氨基酸按照Kabat的规定(Kabat，E.A.等，美国健康和人类服务部，美国政府印刷局，1991)分别为酪氨酸和天冬氨酸。
本发明还涉及含人源化抗体L链V区的多肽，该人源化抗体含如SEQ ID NO48-51所示的任意一种氨基酸序列。
本发明进一步涉及含人源化抗体L链V区的多肽，其中框架区的第45位和87位氨基酸按照Kabat的规定分别为赖氨酸和异亮氨酸。
本发明还进一步涉及含人源化抗体L链V区的多肽，该人源化抗体含如SEQ ID NO52-55所示的任意一种氨基酸序列。
本发明进一步涉及含人源化抗体H链V区的多肽，该人源化抗体包括人抗体H链V区的框架区1到4以及抗人PTHrP的鼠单克隆抗体H链V区的互补决定区1到3。该互补决定区1到3分别包括含SEQ IDNO62-64所示的氨基酸序列，该框架区1到4包括来源于人亚群III(人亚群III(HSG III)，Kabat，E.A.等，美国健康和人类服务部，美国政府印刷局，1991)的人抗体的框架区1到4，尤其是那些分别来源于人抗体S31679的框架区1到4的序列，或者分别与人抗体S31679的框架区1到4基本上等同的序列。
本发明还涉及包含SEQ ID NO56所示氨基酸序列的人源化抗体的H链V区的多肽。
本发明还涉及含所述人源化抗体L链V区多肽以及含人抗体L链C区多肽的抗人PTHrP的人源化抗体的L链。C区包括Cλ区，框架区1到3包括基本上分别与人抗体HSU03868的框架区1到3等同的序列，框架区4包括基本上与人抗体S25755的框架区4等同的序列，互补决定区1到3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO59-61表示的序列。
本发明还涉及抗人PTHrP人源化抗体的H链，该人源化抗体包含所述人抗体H链C区和H链V区的多肽。C区包括Cγ1区，框架区1到4包括来源于HSGIII的人抗体的框架区1到4，互补决定区1到3分别为SEQ ID NO62-64所示的氨基酸序列。
仍进一步，本发明还涉及具有弱抗原性和高度中和活性的抗PTHrP抗体。PTHrP抗体包括可以在人类疾病治疗中使用的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和灵长类源化抗体。该抗体具有低解离常数。本发明的该抗体由于其具有低解离常数而具有高度中和活性，因此可以治疗人类疾病。
本发明抗体的解离常数为1.86×10-7[M]或更低，解离率常数为1.22×10-1[l/Sec]或更低，结合率常数为6.55×104[l/M.Sec]或更高。这些常数使用RI标记配基或表面质粒基因组共振传感器通过Scatchard分析测定。
本发明进一步涉及含编码抗人PTHrP的鼠单克隆抗体L链V区或H链V区碱基序列的DNA。上述L链V区和H链V区分别包括SEQID NO45-46所示的氨基酸序列，包括编码L链V区的碱基序列的DNA包括例如，SEQ ID NO65所示序列的，包括编码H链V区的碱基序列的DNA包括SEQ ID NO57所示序列。
另外，本发明也涉及编码所述嵌合L或H链的DNA。编码所述L链的DNA包括，例如，SEQ ID NO65所示的碱基序列，编码所述H链的DNA包括SEQ ID NO57所示的碱基序列。
仍然进一步，本发明还涉及包括编码所述人源化抗体L链V区或H链V区的碱基序列的DNA。含编码L链V区碱基序列的DNA包括SEQ ID NO66-74所示的碱基序列，含编码H链V区碱基序列的DNA包括SEQ ID NO58所示的序列。
本发明还涉及含编码SEQ ID NO47-55所示氨基酸序列之一的碱基序列的人源化抗体的L链V区的DNA。所述DNA包括SEQ IDNO66-74所示的碱基序列。
仍然进一步，本发明涉及编码SEQ ID NO56所示氨基酸序列的人源化抗体的H链V区的DNA。所述DNA包括SEQ ID NO58所示的碱基序列。
本发明进一步涉及含任意一种所述DNA的重组载体。
本发明仍然进一步涉及用所述重组载体转化的转化体。
另外，本发明也涉及制备抗人副甲状腺激素相关蛋白的嵌合或人源化抗体的方法，包括培养所述转化体，从得到的培养物中收集抗人副甲状腺激素相关蛋白的嵌合或人源化抗体。
仍然进一步，本发明还涉及包括所述抗体作为有效成分的药物组合物，或高钙血症抑制剂或低磷酸盐血症促进剂。恶性肿瘤导致钙血，恶性肿瘤相关高钙血症病人通常观察到低磷酸盐血症症状。因此，本发明的抗体可用于治疗恶性肿瘤或用于改善高钙血或低磷酸盐血症症状。恶性肿瘤包括，但不限于，至少选自于下述之一胰腺、肺、咽、喉、舌、齿龈、食道、胃、胆管、乳腺、肾、膀胱、子宫和前列腺癌，以及恶性淋巴瘤。本发明的高钙血症抑制剂可以用于治疗产生高钙血症的任何恶性肿瘤。
下面将详细描述本发明。
1.制备抗人PTHrP的鼠单克隆抗体可以通过骨髓瘤细胞与来源于用抗原免疫接种的动物的抗体产生细胞之间的细胞融合制备杂交瘤，并且从得到的杂交瘤中选择产生特异性抑制PTHrP活性的抗体的克隆，以获得抗PTHrP的鼠单克隆抗体。
(1)抗原的制备用于免疫接种动物的PTHrP包括具有采用重组DNA技术或化学合成制备的PTHrP，和来源于产生高钙血症的癌细胞上清液的PTHrP的全部或部分氨基酸序列的多肽。例如，含已知PTHrP(Kemp，B.E.等，科学(1987)238，1568-1570)第1到第34位氨基酸的多肽[PTHrP(1-34)]可以用作上述抗原。人PTHrP(1-34)具有SEQ ID NO75所示的氨基酸序列。
得到的PTHrP附着于载体蛋白例如甲状腺球蛋白，随后添加佐剂。可以与任何佐剂，包括弗氏的完全和不完全佐剂混和。
(2)免疫接种并收集抗体产生细胞对哺乳动物例如小鼠、大鼠、马、猴、兔、山羊或绵羊使用上述得到的抗原给药。可以用已知方法进行免疫接种，包括静脉注射、皮下注射和腹膜内注射。免疫接种的注射间歇没有特别限制，可以为几天到几星期，最好为4到21天。
最后一次免疫接种后两或三天，收集抗体产生细胞。抗体产生细胞包括脾、淋巴结、和外周血细胞；通常使用脾细胞。用于免疫接种的抗原的单剂量为每只鼠100μg。
(3)抗体滴度的确定为了确定免疫接种动物的免疫反应水平以及从经过细胞融合处理的细胞中选择感兴趣的杂交瘤，测量了免疫接种动物血液中的抗体滴度或抗体产生细胞上清液中的抗体滴度。
抗体测定方法是已知的，包括EIA(酶免疫分析)、RIA(放射性免疫分析)、和ELISA(酶联免疫吸附分析)。
(4)细胞融合用于与抗体生成细胞融合的骨髓瘤细胞包括来源于各种动物例如小鼠、大鼠和人的细胞系，本领域通常提供了这些技术。使用的合适细胞系是具有药物抗性，在选择性培养基例如HAT培养基中非融合状态不能存活，而融合状态能够存活的细胞系。通常使用8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，其缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能在次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)培养基中生长。
可以使用的合适骨髓瘤细胞包括各种已知细胞系，例如P3(P3×63Ag8.653)(免疫学杂志，(1979)1231548-1550)；P3×63Ag8U.1(微生物学和免疫学当前主题(1978)811-7)；NS-1(Kohler，G和Milstein，C.欧洲免疫学杂志(1976)6511-519)；MPC-11(Margulies，D.H.等，细胞(1976)8405-415)；SP2/0(Shulman，M.等，自然(1978)8276269-270)；FO(de St.Groth，S.F.等，免疫学方法杂志(1980)351-21)；S194(Trowbridge，I.S.，实验医学杂志(1978)148313-323)；和R210(Galfre，G等，自然(1979)277131-133)。
可以从脾细胞、淋巴结细胞等获得抗体产生细胞。即，从上述任一种动物提取或分离脾、淋巴结等，压碎组织。得到的压碎的材料在培养基或缓冲液中悬浮，例如PBS、DMEM或RPMI1640，用不锈钢筛等过滤并离心以制备所需的抗体生成细胞。
然后，所述骨髓瘤细胞和抗体生成细胞进行细胞融合。
细胞融合可以按照下述方式进行将骨髓瘤细胞和抗体生成细胞以1∶1到1∶10的比率在培养动物细胞的培养基中例如MEM、DMEM或RPME-1640混合，同时加入融合促进剂于30到37℃保持1到15分钟。为加速细胞融合，可以使用一些融合促进剂或病毒，例如平均分子量为1000到6000的聚乙二醇、聚乙烯醇或仙台病毒。也可以在商业细胞融合仪中用电刺激例如电穿孔使抗体生成细胞和骨髓瘤细胞融合。
(5)杂交瘤的选择和克隆细胞融合后从细胞选择感兴趣的杂交瘤，例如可以使用在选择培养基中细胞选择性生长的方法进行筛选。
即，用合适的培养基稀释细胞悬浮液并接种到微滴平板上培养，每孔加入选择培养基例如HAT培养基培养，适当时用新鲜培养基更换选择培养基进行保温。
因此，选择生长的细胞作为杂交瘤。
然后用限制性稀释、荧光活化的细胞分类仪或其它方法筛选这些杂交瘤。最后，获得生成单克隆抗体的杂交瘤。
(6)单克隆抗体的收集从获得的杂交瘤中收集单克隆抗体的方法包括常规细胞培养法和腹水形成法。
细胞培养法中，杂交瘤培养在培养动物细胞的培养基中，例如含10％到20％胎牛血清的PRMI-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基中，常规条件(例如，37℃，5％CO2)培养2到14天，从上清液中收集抗体。
腹水形成法中，将杂交瘤在与骨髓瘤细胞相同来源的哺乳动物腹膜内接种以使杂交瘤大量生长。1到4周后，收集腹水或血清。
如果需要纯化这些方法中的抗体，可以任意选择或组合已知的方法例如硫酸铵沉淀、离子交换色谱和亲合色谱。
2.嵌合抗体的构建(1)含编码抗人PTHrP的鼠单克隆抗体V区的碱基序列的DNA的克隆(i)mRNA的制备为克隆含编码抗人PTHrP的鼠单克隆抗体V区的碱基序列的DNA，用常规方法处理收集的杂交瘤，例如，胍-超离心(Chirgwin，J.M.等，生物化学(1979)18，5294-5299)，或AGPC法(Chomczynski，P等，分析生化(1987)162，156-159)，以制备总RNA，其中mRNA通过，例如，附加在mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)上的低聚(dT)-纤维素填充柱制备。也可以使用快速预备mRNA纯化试剂盒(Pharmacia AB)制备mRNA而不必提取总RNA。
(ii)cDNA的制备和扩增用上述(i)中获得的mRNA，用逆转录酶合成L和H链的V区的每一cDNA。在cDNA的合成中，低聚-dT引物或其它与L或H链C区杂交的合适引物，例如，可以使用具有SEQ ID NO1所示碱基序列的MHC2引物。
在cDNA的合成中，所述mRNA和引物混合，在逆转录酶存在下能够实现反应，反应条件为例如，52℃，30分钟。
可以通过5’-RACE法基础上的PCR(聚合酶链反应)使用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(CLONTECH Inc.)扩增L链和H链的cDNA(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究，17，2919-2932，1989)。因此，将AmpliFINDER锚(SEQ ID NO42)连接于上述合成的cDNA的5’末端，PCR合成含编码L和H链V区碱基序列的DNA。(此后，含编码L链V区碱基序列的DNA有时简单地表示为“L链V区的DNA”或“编码L链V区的DNA”。这也同样适用于H链V区、C区等。)可以使用的扩增L链V区DNA的引物包括，例如，锚引物(SEQID NO2)和从鼠抗体Lλ链恒定区(Cλ区)保守序列设计出的引物，例如具有SEQ ID NO4所示碱基序列的ML C引物。可以使用的扩增H链V区DNA的引物包括，例如，锚引物(SEQ ID NO2)和MHC-G1引物(SEQ ID NO3)(S.T.Jones，等，生物技术，9，88，1991)。
(iii)DNA的纯化和碱基序列的确定PCR产物按照常规方法进行琼脂糖凝胶电泳以切下感兴趣的DNA片段，然后回收，纯化并且连接到载体DNA上。
DNA的纯化可以用商业试剂盒例如GENECLEAN II、BIO 101进行。本文适用的运载DNA片段的载体DNA是已知的，例如，pUC19或Bluescript。
用已知连接试剂盒(Takara Shuzo)连接所述DNA和载体DNA以制备重组载体。得到的重组载体导入例如大肠埃希氏杆菌JM109，选择氨苄青霉素抗性菌落；载体DNA用已知方法制备J.Sambrook，等，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。限制性酶消化载体DNA后，再用已知方法例如双脱氧法(J.Sambrook，等，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)确定需要DNA的碱基序列。本发明可以使用自动碱基序列决定装置(DNA测序仪373A；ABI Inc.)。
(iv)互补决定区H和L链V区形成抗原结合位点，它们的整体结构互相具有某些相似。即，四个框架区(FR)部分通过三个高变区或互补决定区(CDR)连接。FR中的氨基酸序列具有相对较高的保守性，而CDR区氨基酸序列的变异性较高Kabat，E.A.等，“免疫相关蛋白序列”美国健康和人类服务部，1983。
四个框架区的许多部分具有β片层结构，因此，三个CDR形成一个环。CDR有时也形成β片层结构的一部分。因此，通过在成对区与三个CDR结合形成抗原结合位点的FR，三个CDR在空间上彼此非常靠近。
鉴于这一事实，可以比较抗人PTHrP的鼠单克隆抗体可变区的氨基酸序列和Kabat等制备的抗体氨基酸序列数据库(“免疫相关蛋白序列”美国健康和人类服务部，1983)寻找CDR区以便研究二者之间的同源性。
(2)嵌合抗体表达载体的构件。
编码鼠单克隆抗体L和H链V区(此后有时也将鼠抗体的L或H链表示为“鼠L链”等，人抗体的L或H链表示为“人H链”等)的DNA片段被克隆后，将编码鼠V区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，并表达产生嵌合抗人PTHrP抗体。
制备嵌合抗体的标准方法涉及将存在于克隆cDNA中的鼠引导序列和V区序列连接到已经存在于哺乳动物细胞表达载体中编码人抗体C区的序列上。或者，存在于克隆cDNA中的鼠引导序列和V区序列连接到编码人抗体C区的序列上，随后连接到哺乳动物细胞表达载体上。
包含人抗体C区的多肽可以是人抗体的任意H或L链C区，包括，例如，人H链的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，或者L链的Cλ或Cκ。
为制备嵌合抗体，首先构建两个表达载体；即，构建了处于表达控制区例如增强子/启动子系统调控下，包含编码鼠L链V区和人L链C区的DNA的表达载体，和处于表达控制区例如增强子/启动子系统调控下，包含编码鼠H链V区和人H链C区DNA的表达载体。然后用这些表达载体共转化宿主细胞例如哺乳动物细胞，转化细胞体外或体内培养以制备嵌合抗体参见，例如，WO91/16928。
或者，存在于克隆cDNA中的鼠引导序列和编码鼠L链V区和人L链C区的DNA以及鼠引导序列和编码鼠H链V区和人H链C区的DNA导入单一表达载体(参见，例如，WO94/11523)，所述载体用于转化宿主细胞；然后体内或体外培养转化的宿主以制备所需的嵌合抗体。
(i)嵌合抗体H链的制备可以将包含编码鼠H链V区碱基序列的cDNA(此后也表示为“H链V区的cDNA”)导入含有包含编码人抗体H链C区碱基序列的基因组DNA(此后也表示为“H链C区的基因组DNA”)或编码所述区的cDNA(此后也表示为“H链C区的cDNA”)的合适表达载体中。H链C区包括，例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4区。
(i-a)含有编码H链C区的基因组DNA的嵌合H链表达载体的构建具有编码H链C区，尤其是编码Cγ1区的基因组DNA的表达载体包括，例如，HEF-PMh-gγ1(WO92/19759)和DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(WO92/19759)。
当编码鼠H链V区的cDNA插入这些表达载体时，可以用PCR法将合适的碱基序列导入所述cDNA。可以用特别设计的PCR引物进行PCR，例如，使得所述cDNA具有识别合适限制性酶的5’端识别序列和紧接在起始密码子之前具有促进转录效能的kozak共有序列，以及使得所述cDNA具有识别合适限制性酶的3’端识别序列和拼接供体位点以将基因组DNA的初级转录产物正确地拼接获得mRNA由此将合适的碱基序列导入表达载体的PCR引物。
编码鼠H链V区的构建的cDNA用合适的限制性酶处理后，即插入所述表达载体以构建包含编码H链C区(Cγ1区)基因组DNA的嵌合H链表达载体。
(i-b)含有包括编码H链碱基序列的cDNA的嵌合H链表达载体的构建具有编码H链C区(例如Cγ1区)cDNA的表达载体可以按照下列方式构建包括编码人源化PM1抗体H链V区的DNA和人抗体H链C区Cγ1(N.Takahashi等，细胞，29，671-679(1982))的基因组DNA的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(参见WO92/19759)以及包括编码人源化PM1抗体L链V区的基因组DNA和人抗体Lκ链C区的基因组DNA的表达载体RV1-PM1a(参见，WO92/19759)导入CHO细胞，从上述CHO细胞制备mRNA，编码人源化PM1抗体H链V区的cDNA和编码人抗体H链C区(Cγ1)的cDNA通过RT-PCR方法克隆，并且连接到用合适限制性酶处理的动物细胞表达载体上，以构建需要的表达载体。
当编码鼠H链V区的cDNA直接连接到编码人抗体H链C区Cγ1的cDNA上时，可以用PCR法将合适的碱基序列导入包含编码H链V区的cDNA的片段。例如，可以用特别设计的PCR引物进行PCR，例如，使得所述cDNA具有5’端识别序列以识别合适的限制性酶并且紧接在密码子之前具有kozak共有序列由此促进转录效能的PCR引物，以及使得所述cDNA具有3’端识别序列以识别合适的限制性酶由此将这些合适的碱基序列导入所述cDNA的PCR引物。
编码鼠H链V区的构建cDNA用合适的限制性酶处理，连接到编码所述H链C区Cγ1的cDNA上，然后插入表达载体例如pCOS1或pCHO1，以构建包含编码嵌合抗体H链cDNA的表达载体。
(ii)嵌合抗体L链的制备可以将编码鼠L链V区的cDNA与编码人抗体L链C区的基因组DNA或cDNA连接起来，并导入合适的表达载体，获得表达嵌合抗体的L链的载体。L链C区包括，例如，κ链和λ链。
(ii-a)包含编码嵌合Lλ链cDNA的表达载体的构建当构建包含编码鼠L链V区cDNA的表达载体时，可以用PCR法将合适的碱基序列导入所述表达载体中。例如，可以用特别设计的PCR引物，例如，使得所述cDNA具有5’端的识别合适限制性酶的识别序列和紧接在密码子之前促进转录效能的Kozak共有序列，以及使得所述cDNA具有3’端识别合适限制性酶的识别序列，由此将合适的碱基序列导入所述cDNA的PCR引物实现PCR。
编码人Lλ链C区的cDNA的全部碱基序列可以用DNA合成仪合成，并用PCR法构建。已知人Lλ链C区具有至少四种不同的同种型，每一型都可以用于构建表达载体。例如，在寻找与克隆的鼠单克隆抗体Lλ链C区的同源性时，可以选择人Lλ链C区片段(登记号X57819)的同种型Mcg+Ke+Oz-(P.Dariavach等美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)用来构建表达载体。为构建已知的人Lλ链C区例如Mcg+Ke+Oz-的cDNA，例如，设计了下面四种如SEQ ID NO11-14所示的引物引物MBC1HGP1(SEQ ID NO11)和MBC1HGP3(SEQ ID NO13)具有有义DNA序列，引物MBC1HGP2(SEQ ID NO12)和MBC1HGP4(SEQ ID NO14)具有反义DNA序列，其中每种引物的每一末端都具有20到23个碱基对的互补序列。
MBC1HGPS(SEQ ID NO15)和MBC1HGPR(SEQ ID NO16)称为外部引物，它们具有分别和MBC1HGP1和MBC1HGP4同源的序列，并且具有合适限制性酶的识别序列。通过PCR法，四种引物被组装起来合成全长cDNA，并且加入外部引物以扩增cDNA。
通过PCR法组装是指MBC1HGP1和MBC1HGP2或MBC1HGP3和MBC1HGP4通过它们的互补序列退火以合成MBC1HGP1-MBC1HGP2片段和MBC1HGP3-MBC1HGP4片段，每一片段再次通过互补序列退火合成编码全长人Lλ链C区的cDNA。
编码人Lλ链C区的构建的cDNA和上述编码鼠L链V区的构建的cDNA可以在合适的限制性酶位点之间连接起来并插入表达载体例如pCOS1或pCHO1，以构建包括编码嵌合抗体Lλ链cDNA的表达载体。
(ii-b)包括编码嵌合Lκ链cDNA的表达载体的构建当包含编码鼠L链V区的cDNA的表达载体构建时，可以用PCR法将合适的碱基序列导入所述cDNA。例如，可以用特别设计的PCR引物进行PCR，例如，使得所述cDNA在其5’末端具有识别合适限制性酶的识别序列和促进转录效能的Kozak共有序列的PCR引物，以及使得所述cDNA具有识别合适限制性酶的3’端识别序列，由此将合适的碱基序列导入所述cDNA的PCR引物。
连接于编码鼠L链V区DNA的编码人Lκ链C区的DNA可以从，例如，含基因组DNA的HEF-PM1k-gk构建(参见WO92/19759)。
可以用PCR法将合适限制性酶的识别序列导入编码Lκ链C的区DNA的5’和3’末端，上述构建的编码鼠L链V区的DNA可以与编码Lκ链C区的DNA彼此连接并插入表达载体例如pCOS1或pCHO1，以构建包括编码嵌合抗体Lκ链cDNA的表达载体。
3.人源化抗体的制备(1)人抗体同源物的筛选为制备鼠单克隆抗体的CDR接支到人抗体上的人源化抗体，期望鼠单克隆抗体的FR和人抗体的FR之间存在高度同源性。因此，对鼠抗人PTHrP单克隆抗体H和L链的V区和应用蛋白数据库描述过结构的所有已知的抗体的V区进行了比较。同时也比较了它们和Kabat等分类的人抗体亚群(HSG人亚群)的抗体FR的长度、氨基酸同源性等Kabat，E.A.等美国健康和人类服务部，美国政府印刷局，1991。
按照Kabat等对HSG的分类人H链V区可以分为HSG I到III，鼠抗人PTHrP单克隆抗体H链V区与HSG III的共有序列具有82.7％的同源性。另一方面，按照Kabat等对HSG的分类人Lλ链C区可以分为HSGI到VI，鼠抗人PTHrP单克隆抗体Lλ链V区与属于任何亚群的人Lλ链V区的共有序列不具有高度同源性。
当鼠抗人PTHrP单克隆抗体人源化时，期望使用的人H链V区属于HSGIII并具有最高度同源性，或者具有相应规范FR结构的人H链V区(Chothia C等，分子生物学杂志，196，901-917，1987)作为人H链V区，用来构建人源化抗体。另外，因为人Lλ链V区亚群不具有最高度同源性的共有序列，构建人源化抗体时期望使用蛋白数据库中已注册的具有高度同源性的人抗体Lλ链V区。
(2)编码人源化抗体V区的DNA的设计设计编码人源化抗体V区的DNA的第一步是选择人抗体V区作为设计的基础。
本发明中，与鼠抗体V区FR的同源性高于80％的人抗体V区的FR可以用于人源化抗体。作为基本上相同FR的框架，H链V区FR可以包括来源于亚群III的FR，例如S31679NBRF-PDB，Cuisinier A.M.等，欧洲免疫杂志，23，110-118，1993。另外，作为基本上相同FR的框架，L链V区的FR可以包括例如，来源于人抗体HSU03868(GEN-BANK，Deftos M.等，Scand.免疫杂志，39，95-103，1994)的FR1、FR2、和FR3以及来源于人抗体S25755(NBRF-PDB)的FR4。
人抗体S31679从人胎肝的cDNA文库克隆，而人抗体HSU03868作为编码人Lλ链V区的新的基因克隆。
(3)包含人源化抗体V区多肽的制备本发明的人源化抗体中，所述抗体的C区和V区的框架区来源于人，V区的互补决定区(CDR)来源于鼠(

图1)。按照本发明可以用PCR法通过称为CDR接支的方式得到包含人源化抗体V区的多肽，只要人抗体的DNA片段可以用作模版。“CDR移植”指一种方法，其中制备编码来源于鼠的CDR的DNA片段，并用其替换作为模版的人抗体的CDR。
如果没有提供用作模版的人抗体的DNA片段，可以用DNA合成仪合成数据库中登记的碱基序列，并可以用PCR法制备编码人源化抗体V区的DNA。另外，当数据库中仅登记了一种氨基酸序列，可以根据Kabat，E.A.等(美国健康和人类服务部，美国政府印刷局，1991)报道的抗体惯用密码子的知识从氨基酸序列推断全部碱基序列。这种碱基序列在DNA合成仪上合成，然后用PCR法制备人源化抗体V区的DNA，并导入合适宿主，随后在其中表达以制备需要的多肽。
当存在作为模版的人抗体DNA片段时，通过PCR法的CDR移植的一般程序描述如下。
(i)CDR移植假设编码V区的DNA包括编码如图2所示按顺序互相连接的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的DNA。
首先，合成来源于鼠的对应于相应CDR的DNA片段。CDR1到3在以前克隆的鼠H和L链V区的碱基序列基础上合成。合成的移植引物B和E，其中应该具有沿有义链方向与鼠CDR1和人抗体FR2杂交的序列，移植引物E应该具有沿反义链方向与CDR1和人抗体FR1杂交的引物(如图2(1))。同样，合成移植引物C和F以及引物D和G。另外，也分别合成了可以与FR1的上游区和FR4下游区杂交的称为“外部引物”并相应地表示为图2(1)的A和H的合适引物。可以按照已知程序分离和提取所述移植引物Sambrook，等，分子克隆实验手册，Cold Spring Harbor实验出版社，1989。
然后，用移植引物E和外部引物A，移植引物B和F，移植引物C和G以及移植引物D和外部引物H进行第一次PCR，分别形成A-E、B-F、C-G和D-H片段(如图2(2))。
因为设计的移植引物B的上游区和部分移植引物E的下游区相互重叠(移植引物C和F以及D和G也同样)，这些片段可以在合适温度条件下反应分别与互补序列退火，然后通过PCR组合从A到H长度的DNA。获得编码V区的DNA片段后，可以加入外部引物A和H，并且进行第二次PCR以生产编码人源化抗体V区的DNA，该人源化抗体FR1到4来源于人，CDR1到3来源于鼠。然后，所述DNA可以导入合适的宿主以表达生产需要的多肽(图2(3))。
(ii)DNA和编码人源化H链V区的表达载体的构建本发明中，作为人源化抗体模版的编码人抗体H链V区DNA的全碱基序列可以通过DNA合成仪合成，并通过PCR法构建，即使所述DNA不能从天然来源获得。
鼠抗人PTHrP单克隆抗体的H链V区与属于人亚群III的S31679高度同源。为了使用这一人抗体作为模版构建编码人源化H链V区的DNA，使用了例如SEQ ID NO23-26所示的四种引物。引物MBC1HGP1(SEQ ID NO23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO24)具有有义DNA序列，引物MBC1HGP2(SEQ ID NO25)和MBC1HGP4(SEQ IDNO26)具有反义DNA序列。其中将每种引物设计为每一末端都具有15到21碱基对的互补序列。
外部引物MBC1HVS1(SEQ ID NO27)和MBC1HVR1(SEQ IDNO28)具有分别和MBC1HGP1和MBC1HGP4同源的序列，并且分别具有合适限制性酶的识别序列。通过PCR法，四种引物被组装起来合成全长cDNA，并且加入外部引物以扩增DNA。“通过PCR法组装”涉及MBC1HGP1和MBC1HGP2或MBC1HGP3和MBC1HGP4通过它们的互补序列退火以合成MBC1HGP1-MBC1HGP3片段和MBC1HGP2-MBC1HGP4片段，每一片段再次通过互补序列退火合成编码人源化H链V区的全长DNA。
人抗体H链C区可以是任何人H链C区，例如，人H链的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。
编码上述构建的人源化抗体H链V区的DNA可以连接到任何人抗体H链C区的DNA上，例如，人H链Cγ1区。如同“嵌合抗体H链的制备”一节所提到的，H链V区的DNA可以用合适的限制性酶处理然后连接到编码人H链V区的DNA上使之处于表达调控区的控制下例如增强子/启动子系统，以制备包含编码人源化H链V区和人H链V区的DNA的表达载体。
(iii)DNA和编码人源化L链V区表达载体的的构建本发明中，用作模板的编码人抗体L链V区DNA的全部碱基序列可以用DNA合成仪合成，用PCR法构建，即使不象编码H链V区的DNA那样L链V区的DNA可获得。
为了构建用作与鼠抗人PTHrP单克隆抗体L链V区有最高同源性的人抗体SU03868的模板的人源化L链V区的DNA，使用了如SEQ IDNO29-32所示的四种引物。引物MBC1LGP1(SEQ ID NO29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO30)具有有义DNA序列，引物MBC1LGP2(SEQ ID NO31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO32)具有反义DNA序列。其中每种引物的每一末端都设计具有15到21碱基对的互补序列。
外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO33)和MBC1LVR1(SEQ IDNO34)分别具有和MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的序列，并且分别具有相应的合适限制性酶的识别序列。通过PCR法，四种引物被组装起来合成全长DNA，并且加入外部引物以扩增DNA。“通过PCR法组装”涉及MBC1LGP1和MBC1LGP3或MBC1LGP2和MBC1LGP4通过它们的互补序列退火以合成MBC1LGP1-MBC1LGP3片段和MBC1LGP2-MBC1LGP4片段，每一片段再次通过互补序列退火合成编码人源化H链V区的全长DNA。
人抗体L链C区可以是任何人L链C区，例如，人L链的Cλ或Cκ。
将编码上述构建的人源化抗体L链V区的DNA可以连接到任何人抗体L链C区的DNA上，例如，人L链Cλ区。L链V区的DNA可以用合适的限制性酶处理然后连接到编码人Lλ链C区的DNA上处于表达调控区例如增强子/启动子系统的控制下，以制备包含人源化L链V区和人Lλ链C区DNA的表达载体。
如果包含人源化抗体V区的多肽可以如上述制备，就不必清楚是否所述多肽具有抗体活性，例如对其抗原的结合或中和活性。尤其对于L链，因为鼠抗人PTHrP单克隆抗体L链V区来源于非常罕见的Vλx基因，就有必要将它和人源化H链结合并在动物细胞例如COS7中表达来研究其是否存在活性。
杂交V区的构建(Ohtomo，T.等，分子免疫学，32，407-416，1995)和证实可以作为说明人源化抗体V区FR有助于人源化抗体的结合和中和活性的有效方法。为了阐明应该突变本发明人源化抗体L链V区中的氨基酸以赋予其活性，构建了人源化抗体FR区片段与来源于鼠的FR区片段重组的DNA，并评价每一区的人源化作用。
如图3所示，制备了具有包含来源于人抗体FR1和FR2和来源于鼠抗体FR3和FR4的重组V区多肽的抗体(例如，具有称作为“杂合抗体”重组片段的抗体)，仅FR1来源于人的杂合抗体，以及仅FR2来源于人的杂合抗体。编码这些杂合抗体的每种DNA分别被导入表达载体，短暂表达人源化抗体以研究是否存在抗体活性。
通过这种方法，本发明人研究了包含L链V区的多肽的抗原结合和中和活性，最后发现存在于FR2和FR3中的某些氨基酸被替换。
发现存在于FR2和FR3区对活性有贡献的氨基酸后，本发明人进一步阐述了FR2区的第36、45、49位的氨基酸和FR3区第87位氨基酸(抗体氨基酸的编号由Kabat，E.A.等确定(美国健康和人类服务部，美国政府印刷局，1991))对活性有贡献。
因此，本发明制备了V区的某个或某些氨基酸被突变(例如替换)的多肽。
首先，通过前述CDR移植法制备包括具有导入了氨基酸序列的某个或某些氨基酸突变V区的多肽作为基础。这种基础多肽包含SEQ IDNO47所示的氨基酸序列，并称之为“a型”(表1中的a)。
然后，以a型为基础，制备FR的一个或一些氨基酸突变的多种变异片段。
可以通过设计编码导致产生需要突变的氨基酸的寡聚核苷酸引物(诱变引物)并用所述引物进行PCR来导入突变。
因此，可以制备V区(b到t型)FR2和FR3的特定氨基酸被突变的多肽(表1中的b到t)。
表1FR1 CDR11 2 312345678901234567890123456789012345MBC H.PEP EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMS*** * * *S31679 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHhMBC1-H.pep ------------------------------SYGMSFR2 CDR24 5 667890123456789 012A3456789012345MBC H.PEP WIRQTPDKRLEWVA TISSGGSYTYYPDSVKG* * * *S31679 WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKGhMBC1-H.pep -------------- TISSGGSYTYYPDSVKGFR3 CDR3 FR47 89 10 1167890123456789012ABC345678901234 567890A12 34567890123MBC H.PEP RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCAR QTTMTYFAY WGQGTLVTVSA** **** *S31679 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ESRGDY WGQGTLVTVSShMBC1-H.pep -------------------------------- QTTMTYFAY -----------
FR1CDR1FR2CDR21 2 3 4 5123456789012345678901234567A890123456789012345678901234ABCD56MBC L.PEPQLVLTQSSS-ASFSLGASAKLTCTLSSQHSTYTIEWYQQQPLKPPKYVMDLKQDGSHSTGD** * ** * * * *HSU03868 QLVLTQSPS-ASASLGASVKLTCTLSSGHSSYAIAWHQQQPEKGPRYLMKLNSDGSHSKGDhMBC1-L.pep -----------------------TLSSQHSTYTIE---------------LKQDGSHSTGDa-------------------------------------------------------------b-------------------------------------------P-----D-----------c-------------------------------------------------------------d-------------------------------------------------------------e-------------------------------------------P-----D-----------f-------------------------------------------------------------g------------------------------------Y------------------------h------------------------------------Y------------------------i------------------------------------Y--------K---------------j------------------------------------Y--------K---D-----------k------------------------------------Y--------K-V-------------l------------------------------------Y--------K-V-D-----------m------------------------------------Y------------D-----------n------------------------------------Y----------V-------------o------------------------------------Y----------V-D-----------p------------------------------------Y--------K---------------q------------------------------------Y--------K---D-----------r------------------------------------Y------------D-----------s------------------------------------Y--------K-V-D-----------t------------------------------------Y----------V-D-----------
FR3 CDR3 FR46 7 8 910 11789012345678901234567890123456789012345ABCD67890123456A7890MBC L.PEP GIPDRFSGSSSGADRYLSISNIQPEDEAMYICGVGDTIKEQFVYVFGGGTKVTVLGQP* * ** ** *HSU03868GIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCQTWGTGIhMBC1-L.pep --------------------------------GVGDTIKEQFVYV------L------a ---------------------------------------------------L------b ---------------------------------------------------L------c -----------------------P---------------------------L------d ------------------------------I--------------------L------e ------------------------------I--------------------L------f -----------------------P------I--------------------L------g ---------------------------------------------------L------h ------------------------------I--------------------L------i ---------------------------------------------------L------j ---------------------------------------------------L------k ---------------------------------------------------L------l ---------------------------------------------------L------m ---------------------------------------------------L------n ---------------------------------------------------L------o ---------------------------------------------------L------p ------------------------------I--------------------L------q ------------------------------I--------------------L------r ------------------------------I--------------------L------s ------------------------------I--------------------L------t ------------------------------I--------------------L------
编码上述构建的人源化抗体L链V区每种类型的DNA可以连接到任何人抗体L链C区的DNA上，例如人L链Cλ区。因此用合适的限制性酶处理它，并连接到编码人Lλ链C区的DNA上以在表达调控序列例如增强子/启动子系统的控制下，以构建包含编码人源化L链V区每种类型的DNA和编码人源化Lλ链C区DNA的表达载体。
以前构建的编码人源化抗体H链V区和人H链C区的DNA以及编码人源化L链V区和人L链C区的DNA也可以导入单一表达载体例如WO94/11523公开的载体，所述载体可以用于转化宿主细胞，转化的宿主可以在体内或体外培养以制备需要的人源化抗体。
4.嵌合抗体和人源化抗体的制备为制备嵌合或人源化抗体，应该制备上述的两种表达载体。因此，对于嵌合抗体，构建了包含在表达调控区例如增强子/启动子系统控制下编码鼠H链V区和人H链C区的DNA的表达载体，以及包含在表达调控区例如增强子/启动子系统控制下编码鼠L链V区和人L链C区的DNA的表达载体。对于人源化抗体，构建了包含在表达调控区例如增强子/启动子系统控制下编码人源化H链V区和人H链C区DNA的表达载体，以及包含在表达调控区例如增强子/启动子系统控制下编码人源化L链V区和人L链C区DNA的表达载体。
然后用这些表达载体共转化宿主细胞例如哺乳动物细胞，得到的转化细胞体内或体外培养以制备嵌合或人源化抗体(参见，例如，WO91/16928)。
或者，编码H链V区和C区的DNA和编码L链V区和C区的DNA可以连接到单一载体上并转化合适的宿主细胞以制备抗体。因此，在嵌合抗体的表达中，编码存在于克隆cDNA中的鼠引导序列、鼠H链V区和人H链C区的DNA，以及编码鼠引导序列、鼠L链V区和人L链C区的DNA被导入单一表达载体例如WO94/11523所公开的载体。在人源化抗体的表达中，编码人源化H链V区和人H链C区的DNA，以及编码人源化L链V区和人L链C区的DNA被导入单一表达载体例如WO94/11523所公开的载体。这样的一种载体用于转化宿主细胞，转化宿主在体内或体外培养以制备感兴趣的嵌合或人源化抗体。
这样通过培养用编码所述嵌合或人源化抗体的DNA转化的转化体制备的感兴趣的嵌合或人源化抗体可以从细胞内部或外部分离出来并纯化为单体。
本发明的感兴趣的嵌合或人源化抗体可以使用蛋白A琼脂糖柱分离和纯化，但也可以使用常规蛋白的分离纯化方法，因此该步骤没有限制。例如，可以非强制性选择或组合各种色谱法、超滤、盐析和透析方法以分离和纯化嵌合或人源化抗体。
可以使用任何表达系统制备本发明的抗人PTHrP嵌合或人源化抗体。例如，真核细胞包括动物细胞例如已建立的哺乳动物细胞系、霉菌和真菌细胞、以及酵母细胞；原核细胞包括细菌细胞例如大肠埃希氏杆菌细胞。本发明的嵌合或人源化抗体优选在哺乳动物细胞例如COS或CHO细胞中表达。
可以使用用于哺乳动物细胞表达的任何常规启动子。例如，人细胞巨大病毒(HCMV)即早期启动子是优选使用的。含HCMV启动子的表达载体的例子包括来源于pSV2neo的HCMV-VH-HCγ1和HCMV-VL-HCK(WO92/19759)。
另外，本发明可以使用的用于哺乳动物细胞中基因表达的启动子包括病毒启动子，例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒(SV)40，以及来源于哺乳动物细胞的启动子，例如人多肽链延长因子-1α(HEF-1α)。例如，按照Mulligan等的方法(自然，277，108，1979)可以方便地使用SV40启动子；按照Mizushima等的方法(核酸研究，18，5322，1990)可以方便地使用启动子HEF-1α。
本发明可用的复制起点包括来源于SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳突淋瘤病毒(BPV)的复制起点。另外表达载体可以包含磷酸转移酶APH(3’)II或I(neo)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因或二氢叶酸还原酶(DHFR)基因作为增加宿主细胞系统中基因拷贝数的选择性标识物。
5.嵌合抗体和人源化抗体的抗原结合和中和活性的评价(1)抗体浓度的确定得到的纯化抗体的浓度可以用ELISA法确定。
按照以下方式制备测定抗体浓度的ELISA平板制备的浓度为例如1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体100μl固定在用于ELISA的96孔平板的每个孔中(例如，Maxisorp，NUNC)。用200μl稀释缓冲液隔断后(例如，50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％吐温20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，每孔加入逐步稀释的有嵌合、杂合或人源化抗体表达的COS-7或CHO细胞上清液，或者纯化的嵌合、杂合或人源化抗体，加入100μl碱式磷酸酶结合山羊抗人IgG抗体，然后加入1毫克/毫升基础溶液(Sigma 104，对-硝基苯磷酸，SIGMA)，随后用微平板读数仪(Bio Rad)测定405nm处的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)可以用作浓度测定中的标准品。
(2)抗原结合能力的确定确定抗原结合能力的ELISA平板按照下述方式制备制备的浓度为1μg/毫升的人PTHrP(1-34)100μl固定在用于ELISA的96孔平板的每个孔中。用200μl稀释缓冲液隔断后，每孔加入逐步稀释的有嵌合、杂合或人源化抗体表达的COS-7或CHO细胞上清液中，或者纯化的嵌合、杂合或人源化抗体中，加入100μl碱式磷酸酶结合山羊抗人IgG抗体，然后加入1毫克/毫升基础溶液(Sigma 104，对-硝基苯磷酸，SIGMA)，随后用微平板读数仪(Bio Rad)测定405nm处的吸收值。
(3)中和活性的确定可以通过例如大鼠骨肉瘤细胞系ROS17/2.8-5细胞确定鼠、嵌合和人源化抗体的中和活性(Sato，K等，内分泌学公报，116，113-120，1987)。因此，用4mM氢化可的松刺激ROS17/2.8-5细胞以诱导PTH/PTHrP受体。cAMP降解酶与1mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，SIGMA)抑制。待测定中和活性的鼠、嵌合或人源化抗体与等量PTHrP(1-34)混合，得到的每种抗体和PTHrP(1-34)的混合物分别加入平板的各个孔中。可以通过测量大鼠骨肉瘤细胞系ROS17/2.8-5细胞由于用PTHrP刺激导致cAMP产生的数量评估鼠、嵌合或人源化抗体的中和活性。
(4)PTHrP和抗PTHrP抗体之间相互作用的动力学分析本发明可以用多种方法和程序分析PTHrP和抗PTHrP之间相互作用的动力学。特别是，可以通过Scatchard分析法和称为BIACORE的表面胞质团共振传感器(Pharmacia Biotech研究开发)测定解离常数、解离率常数和结合率常数。称为BIACORE的表面胞质团共振传感器分析将在后文作为一个实施例描述。
BIACORE的基本结构包括光源、棱镜、检测器和微通道。操作中，配基固定在盒式传感器顶部，被分析物注射入传感器。当它们之间存在亲和力时，即可光学测定结合量。
检测原理是称为表面胞质团共振现象。即，入射光照射到玻璃盒金属膜之间的表面，以至发生全反射，某一角度的入射光用于刺激表面胞质团，随后衰减。角度随着与金属膜(传感器)接触溶剂浓度的变化而改变。BIACORE即检测这种改变。
BIACORE中，这种变化称为共振信号(SPR信号)，0.1度的改变为1000RU(共振单位)。1000RU对应约1纳克蛋白结合到表面积为1mm2的金薄层传感器上的变化。对于蛋白，50RU(50pg)的变化就完全可以检测得到。
检测信号由附在BIACORE上的计算机转化成结合曲线，其被称为传感图，该图由计算机即时显示Natsume，T.等(1995)，实验医学，13，563-569；Karlsson，R.等(1991)免疫方法学杂志145，229-240。
本发明抗PTHrP抗体的动力学参数，即解离常数(KD)、解离率常数(Kdiss)和结合率常数(Kass)可以通过上述BIACORE方法测定。
考虑到中和活性，本发明的抗PTHrP抗体最好具有尽可能小的解离常数(KD值)。本发明的抗PTHrP抗体优选KD值为1.86×10-7或更低，更优选的是1.8×10-8或更低，最优选的是3.58×10-10或更低。
KD值通过两个参数确定，解离率常数(Kdiss)和结合率常数(Kass)(KD＝Kdiss/Kass)。因此可以看到，当Kdiss值较小而Kass值较大时KD值较小。
尤其，本发明的抗PTHrP抗体Kdiss值可以为1.22×10-1[l/Sec]或更低。Kdiss值优选1.22×10-2[l/Sec]或更低，更优选3.16×10-4[l/Sec]或更低，最优选2.32×10-4[l/Sec]或更低。
另一方面，Kass值可以为6.55×104[l/M.Sec]或更高。Kass值优选6.55×105[l/M.Sec]或更高，更优选0.883×106[l/M.Sec]或更高，最优选1.03×106[l/M.Sec]或更高。
并且还优选的Kdiss值为1.22×10-1[l/Sec]和Kass值可以为6.55×104[l/M.Sec]或更高的抗PTHrP抗体。
更具体地说，本发明的抗PTHrP抗体的KD值范围为1.02×10-11到1.86×10-7[M]，优选1.02×10-10到1.86×10-8[M]，更优选1.34×10-10到3.58×10-10[M]，最优选2.25×10-10到3.58×10-10[M]。
Kdiss值在7.38×10-6到1.22×10-1[l/Sec]之间，优选7.38×10-5到1.22×10-2[l/Sec]，更优选1.66×10-4到3.16×10-4[l/Sec]，最优选1.66×10-4到2.32×10-4[l/Sec]之间。
Kass值在6.55×104到1.24×107[l/M.Sec]之间，优选6.55×105到1.24×106[l/M.Sec]，更优选7.23×105到1.03×106[l/M.Sec]，最优选0.883×106到1.03×106[l/M.Sec]之间。
这些KD、Kdiss和Kass值可以通过Scatchard分析或表面胞质团共振传感器例如BIACORE，并且最好是BIACORE测定。
6.含抗PTHrP抗体或人源化抗体作为有效成分的药剂组合物和高钙血症抑制剂。
可以通过给表现高钙血症的动物使用抗PTHrP抗体或人源化抗体给药并测定高钙血症指标来确定人源化抗体抗PTHrP的治疗作用。表现高钙血症的动物或高钙血症病人中，通常观察到低磷酸盐血症；本发明的抗体也可以用于改善低磷酸盐血症。
本发明使用的抗体是抗PTHrP抗体，包括具有解离常数、解离率常数和结合率常数的抗PTHrP人抗体、嵌合抗体和灵长类化或人源化抗体。该抗体通过与PTHrP结合而中和了PTHrP活性，该抗体特别优选，人源化#23-57-137-1抗体。人源化#23-57-137-1抗体的制备方法将在实施例1到3中描述。
本发明使用的抗体可以通过常规纯化方法例如盐析、应用HPLC等的凝胶过滤、和使用蛋白A柱等的亲合色谱的组合得到高度纯化的纯品。因此可以通过常规免疫方法例如放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA，ELISA)或免疫荧光分析确定纯化抗体对PTHrP识别的高精确性。
可以使用的表现高钙血症的动物包括将产生PTHrP的肿瘤细胞移植到免疫功能降低或缺乏的实验动物中而制备的模型动物。移植的肿瘤细胞最好来源于人类，包括，例如，人胰腺癌PAN-7。植入肿瘤细胞的免疫功能低下或缺乏的动物包括裸鼠和SCID鼠。
可以通过观察血液中的钙浓度，体重的降低，或者随流逝时间运动程度的减少以及测定改善程度评价对高钙血症的抑制作用。
含本发明抗PTHrP抗体或抗PTHrP人源化抗体作为有效成分的药剂组合物和高钙血症抑制剂可以非肠道系统给药或局部给药。例如，可以选择静脉注射包括滴注、肌肉注射、腹膜内注射、或皮下注射。可以根据病人的年龄和疾病状况选择合适的给药方式。有效的单剂量可以从每公斤体重0.01到1000毫克范围内选择。或者，给药剂量为5到10000毫克/体重，优选50到1000毫克/体积。
含本发明抗PTHrP抗体或抗PTHrP人源化抗体作为有效成分的药剂组合物和高钙血症抑制剂可以根据给药途径进一步包括药物学可接收载体和/或添加剂。这种载体和添加剂的例子可以包括水、药物学可接收的有机溶剂、胶原、聚丙烯醇、聚丙烯吡咯烷酮、羧丙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、二甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可以作为药物添加剂的表面活性剂。使用的添加剂可以选择上述之一或组合，单不限于此。
本发明抗体可以广泛用于高钙血症相关的各种癌症(恶性肿瘤)。这些癌症没有特别限制，不仅包括单一癌症而且包括许多癌症的并发。癌症还包括例如胰腺、肺、咽、喉、齿龈、食道、胃、胆管、乳腺、肾、膀胱、子宫和前列腺癌，以及恶性淋巴瘤。
附图简介图1为本发明抗体的图示说明；图2为CDR-移植的图示说明；图3为确定FR和V区CDR的说明；图4为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图5为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图6为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图7为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图8为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图9为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图10为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图11为抗体的抗原结合活性的测量结果显示图；图12为人源化抗体的中和活性显示图；图13为人源化抗体的中和活性显示图；图14为人源化抗体的中和活性显示图；图15为本发明抗体对高钙血症模型动物治疗效果的说明图；图16为本发明抗体对高钙血症模型动物治疗效果的说明图；图17为本发明抗体对高钙血症模型动物治疗效果的说明图；图18为本发明抗体对高钙血症模型动物治疗效果的说明图；图19为说明PTHrP固定到传感器顶部的传感图；图20为本发明抗体动力学分析的结果图；图21为本发明抗体动力学分析的结果图；图22为本发明抗体动力学分析的结果图；
图23为本发明抗体动力学分析的结果图；图24为本发明抗体动力学分析的结果图；图25为本发明人源化抗体对局部磷酸盐分泌影响的测定结果图；图26为本发明人源化抗体对血浆磷浓度影响的测定结果图；图27为使用本发明抗PTHrP抗体给药后高钙血症模型鼠临床表观症状的照片(活动物的形态)；图28为使用本发明抗PTHrP抗体给药后高钙血症模型鼠临床表观症状的照片(活动物的形态)；图29为与使用生理盐水给药的对照模型动物相比高钙血症模型动物使用本发明抗PTHrP抗体给药后一段时间的活性变化图。
图30为与使用生理盐水给药的对照模型动物相比高钙血症模型动物使用本发明抗PTHrP抗体给药后一段时间的体温变化图。
图31为与使用生理盐水给药的对照模型动物相比高钙血症模型动物使用本发明抗PTHrP抗体给药后一段时间的血液pH变化图。
实施例下文将参考下列实施例详细描述本发明，这些实施例不应该构成本发明范围的限制。
参考实施例1产生抗-PTHrP(1-34)鼠单克隆抗体的杂交瘤的制备能够产生抗人PTHrP(1-34)、#23-57-154和#23-57-137-1单克隆抗体的杂交瘤按照Kanji Sato等报道的方法制备(Sato，K.等，Bone Miner.研究杂志，8，849-860，1993)。
使用的免疫原是PTHrP(1-34)(Peninsula)，用碳二亚胺(Dojinn)将所述PTHrP键合到载体蛋白，甲状腺球蛋白上。透析甲状腺球蛋白键合PTHrP(1-34)获得蛋白浓度为2μg/毫升的溶液。得到的溶液与弗氏佐剂(Difco)以1∶1的比例混合得到乳剂。该乳剂以100μg/只鼠的剂量分别对16只雌鼠BALB/C背部皮下注射或腹膜内注射以免疫接种鼠。注射11次。关于佐剂，第一次免疫注射时使用弗氏完全佐剂，随后的免疫注射中使用弗氏不完全佐剂。
以下列方式测定每只免疫接种鼠血清中的抗体滴度。
从每只鼠尾静脉取血，然后离心该血样获得血清。血清用RIA缓冲液稀释，与125I-标记的PTHrP(1-34)混合，然后测定其结合活性。已经确定具有令人满意的高抗体滴度的鼠以50μg/只鼠的剂量腹膜内注射无载体蛋白的PTHrP(1-34)作为最后免疫接种。
最后免疫接种后三天，处死鼠，切除它们的脾。然后，按照已知的常规方法用50％聚乙二醇4000使脾细胞与鼠骨髓瘤细胞系P3×63Ag8U.1进行细胞融合。如此制备的融合细胞在96孔的平板中以2×104/孔的量在85个孔中培养。感兴趣的杂交瘤通过HAT培养如下述进行筛选。
用固相RIA法确定HAT培养基中观察到细胞生长的孔的培养物上清液中PTHrP-识别抗体的存在来筛选杂交瘤。从明确具有识别PTHrP-抗体结合能力的孔中收集杂交瘤。获得的杂交瘤悬浮于含15％FCS并添加OPI-补充物(Sigma)的RPMI-1640培养基中，随后采用限制稀释法匀化杂交瘤，因此获得两种杂交瘤克隆类型，#23-57-154和#23-57-137-1，均对PTHrP(1-34)表现强结合能力。
指定为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137-1”的杂交瘤克隆#23-57-137-1已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国家生物科学和人类技术所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，登记号为FERM BP-5631。
实施例1
编码鼠抗人PTHrP(1-34)单克隆抗体V区DNA的克隆编码上述从#23-57-137-1获得的鼠抗人PTHrP(1-34)单克隆抗体V区的DNA，按照下列方式进行克隆。
(1)mRNA的制备从杂交瘤#23-57-137-1用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)如下述制备mRNA。
上述获得的杂交瘤#23-57-137-1细胞用提取缓冲液完全匀化，用低聚(dT)-纤维素旋转柱按照试剂盒生产商规定的程序从其中提取mRNA。提取溶液用乙醇沉淀获得作为沉淀的mRNA。mRNA沉淀溶解于洗脱缓冲液。
(2)编码鼠H链V区基因的cDNA的制备和扩增(i)#23-57-137-1抗体H链V区的cDNA的克隆编码抗人PTHrP鼠单克隆抗体H链V区的DNA通过5’-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。该方法用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(CLONETECH)按照生产商的程序进行。该方法中，用于合成cDNA的引物是MHC2引物(SEQ ID NO1)，其可与鼠H链C区杂交。作为cDNA合成模板的2μg上述获得的mRNA与10pmoles MHC2引物混合。得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟以制备与mRNA互补的cDNA。
产物与6N NaOH混合以水解其中的mRNA(65℃反应30分钟)，然后乙醇沉淀分离作为沉淀的cDNA。如此分离到的cDNA与T4RNA连接酶在37℃反应6小时另外室温反应16小时，以使cDNA连接到Ampli FINDER Anchor(SEQ ID NO42)的5’末端上。使用了锚引物(SEQ ID NO2)和MHC-G1引物(SEQ ID NO3)作为PCR法扩增cDNA的引物(S.T.Jones等，生物技术，9，88，1991)。
该方法中使用的PCR溶液(50μl)包括10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.25mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，2.5单位TaKaRa Taq(Takara Shuzo)，10pmoles锚引物，和1μl MHC-G1引物和Ampli FINDER Anchor引物连接其上的cDNA反应混合物，并且该混合物用50μl矿物油液封。用热循环仪480J型(Perkin Elmer)进行PCR反应30个循环，循环温度为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
(ii)#23-57-137-1抗体L链V区的cDNA的克隆编码抗人PTHrP鼠单克隆抗体L链V区的DNA通过5’-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。该方法用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(Clonetech)按照生产商的程序进行。该方法中，低聚-dT引物用作合成cDNA的引物。2μg上述mRNA(作为cDNA合成模板)与低聚-dT引物混合。得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟以制备cDNA。产物与6N NaOH混合以水解其中的RNA(65℃反应30分钟)，得到的混合物用乙醇沉淀分离作为沉淀的cDNA。如此合成的cDNA与T4RNA连接酶在37℃反应6小时另外室温反应16小时，以使cDNA连接到Ampli FINDER Anchor的5’末端上。
在鼠L链λ链C区保守序列的基础上设计PCR引物ML C(SEQ IDNO4)，然后用394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。用于合成引物的PCR溶液(100μl)包括10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.25mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，2.5单位AmpliTaq(PerkinElmer)，50pmoles锚引物(SEQ ID NO2)，和1μl ML C(SEQ ID NO4)引物和Ampli FINDER锚引物连接其上的cDNA反应混合物，上面覆盖50μl矿物油。用热循环仪480J型(Perkin Elmer)进行PCR反应35循环，温度循环为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
(3)PCR产物的纯化和裂解成片段上述PCR法扩增的每种DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖凝胶电泳分离。分别从凝胶上切下长度约为550碱基对DNA片段的每种H链V区和L链V区的琼脂糖凝胶片段。获得的每种凝胶组份用GENECLEAN II试剂盒(BIO 101)按照生产商提供的程序纯化其中的DNA。纯化的DNA用乙醇从溶液中沉淀出来，然后溶解于含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的20μl溶液中。这样制备的DNA溶液1μl用限制性酶XmaI(New England Biolabs)于37℃消化1小时，另外用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)于37℃消化1小时。消化混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集DNA。
按照这种方式使得获得的编码鼠H链V区的DNA和编码鼠L链V区的DNA都具有5’末端EcoRI识别序列和3’末端XmaI识别序列。
每一种包含编码鼠H链V区DNA和编码鼠L链V区DNA的EcoRI-XmaI DNA片段分别与事先用EcoRI和XmaI消化的pUC19载体使用DNA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)按照生产商推荐的程序于16℃反应1小时，以彼此连接。获得的连接混合物(10μl)加入100μl含大肠杆菌JM109(Nippon Gene)感受态细胞的溶液。冰上静置细胞混合物15分钟，42℃静置1分钟，然后再于冰上静止1分钟。产物与300μlSOC培养基混合(分子克隆实验室手册，Sambrook，等，Cold SpringHarbor Laborarory Press，1989)，于37℃保温30分钟。得到的细胞溶液接种到添加100或50μg/毫升氨苄青霉素，0.1mM IPTG和20μg/毫升X-gal的LB或2×YT琼脂培养基上(分子克隆实验室手册，Sambrook，等，Cold Spring Harbor Laborarory Press，1989)，然后于37℃保温过夜。按照这种方式，即可制备大肠杆菌转化体。
该转化体在含100或50μg/毫升氨苄青霉素的2毫升LB或2xYT培养基上于37℃培养过夜，然后用质粒提取仪PI-100∑(Kurabou)或QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片制备质粒DNA。确定获得的质粒DNA的序列。
(4)编码鼠抗体V区的cDNA序列承载于质粒上的编码区cDNA序列用染料终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)由DNA测序仪373A(ABI；Perkin-Elmer)确定。这是通过使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO5)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO6)确定两个方向上碱基序列的DNA测序方法。
获得的包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的cDNA和编码鼠L链V区cDNA的质粒分别被指定为“MBC1H04”和“MBC1L24”。编码鼠#23-57-137-1抗体H链V区的DNA序列和L链V区的DNA序列(包括相应的氨基酸序列)(分别承载于质粒MBC1H04和质粒MBC1L24)分别如SEQ ID NO57和65所示。H链V区片段和L链V区片段的多肽都从SEQ ID NO57和65所示DNA序列的第58个碱基(编码谷氨酰胺)开始翻译。H链V区和L链V区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO46和45所示。
具有质粒MBC1H04的大肠杆菌和具有质粒MBC1L24的大肠杆菌分别被指定为“大肠杆菌JM109(MBC1H04)”和“大肠杆菌JM109(MBC1L24)”。这些大肠杆菌株系已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国家生物科学和人类技术所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大肠杆菌JM109(MBC1H04)的登记号为FERM BP-5628，大肠杆菌JM109(MBC1L24)的登记号为FERM BP-5627。
(5)抗人PTHrP鼠单克隆抗体#23-57-137-1CDR的确定H链V区和L链V区的一般结构彼此相似。即，两者都有通过三个高可变区(即，互补决定区(CDR))连接四个框架区的结构。框架区的氨基酸序列相对保守，而CDR区的氨基酸序列表现相当高的诱变性(Kabat，E.A.等，“具有免疫活性的蛋白序列”，美国健康和人服务部门，1983)。
基于上述事实，可以参考Kabat，E.A.等建立的抗体氨基酸序列数据库通过检索鼠单克隆抗体V区氨基酸序列的同源性确定CDR。
L链V区中CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO59-61所示，H链V区中CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO62-64所示。
表2

实施例2嵌合抗体的构建(1)嵌合抗体H链的构建(i)H链V区的构建编码鼠H链V区的克隆cDNA用PCR法修饰，以将其连接到携带人H链V区Cγ1基因组DNA的表达载体上。使用的下游侧端引物MBC1-S1(SEQ ID NO7)设计为可以与编码V区引导序列5’-末端区的DNA杂交，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)和HindIII-识别序列。使用的上游引物MBC1-a(SEQ ID NO8)设计为可以与编码J区3’-末端区的DNA杂交，并具有接合供体序列和BamHI-识别序列。使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)并添加缓冲液进行PCR反应。使用的PCR溶液(50μl)包括0.07μg的质粒MBC1H04作为模版DNA的，50pmole的MBC1-a和50pmole的MBC1-S1作为引物，添加到缓冲液中2.5U的TaKaRaEx Taq和0.25mM的dNTP，液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行30次循环，温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃2分钟。PCR反应扩增的DNA片段使用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖电泳分离。
然后，除下含长度为437碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒商介绍的方法纯化DNA片段。纯化的DNA通过乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。得到的DNA溶液一微升用限制性酶BamHI和HindIII(Takara Shuzo)于37℃消化1小时。消化混合物用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。
获得的包含编码鼠H链V区DNA的HindIII-BamHI DNA片段亚克隆到用HindIII和BamHI消化过的pUC19载体。得到的质粒使用M13引物M4和M13引物RV作为引物，和染料终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测序。包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的正确碱基序列的DNA并具有5’末端区的HindIII识别序列和Kozak序列以及3’末端区的BamHI识别序列的质粒被指定为“MBC1H/pUC19”。
(ii)用于制备鼠-人嵌合H链cDNA型的H链V区的构建上述步骤构建的编码鼠H链V区的DNA用PCR法修饰，以使其连接到人H链C区Cγ1的cDNA上。设计了用于修饰H链V区的反向引物MBC1HVS2(SEQ ID NO9)以便用甘氨酸替代编码V区引导序列前面部分序列的第二个氨基酸(即，天冬氨酸)，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)及HindIII-和EcoRI-识别序列。同时设计了用于修饰H链V区的正向引物MBC1HVR2(SEQ ID NO10)以便可与编码J区3’末端区的DNA序列和编码C区5’末端区的DNA杂交，并具有ApaI-和SmaI-识别序列。
使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)及所附的缓冲液进行PCR反应。使用的PCR溶液(50μl)包括0.6μg的质粒MBC1H/pUC19作为模版DNA，50pmole的MBC1HVS2和50pmole的MBC1HVR2作为引物，缓冲液中的2.5U的TaKaRa Ex Taq和0.25mM的dNTP，液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行30次循环，温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。PCR反应扩增的DNA片段使用1％Sea KemGTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖电泳分离。然后，切下含长度为456碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒商介绍的方法纯化其中的DNA片段。纯化的DNA乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
得到的DNA溶液一微升用限制性酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo)于37℃消化1小时。消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。获得的包含编码鼠H链V区DNA的EcoRI-SmaI DNA片段亚克隆到用EcoRI和SmaI消化过的质粒pUC19载体上。得到的质粒使用M13引物M4和M13引物RV作为引物，和染料终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测序。包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的正确碱基序列的DNA并具有5’末端区HindIII识别序列和Kozak序列以及3’末端区ApaI和SmaI识别序列的质粒被指定为“MBC1Hv/pUC19”。
(iii)嵌合抗体H链表达载体的构建包含人抗体H链C区Cγ1的cDNA按照如下方法制备。
从将编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体H链C区IgG1的基因组DNA的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f(见WO92/19759)和编码人源化PM1抗体L链V区和人抗体L链κ链C区的基因组DNA的表达载体RV1-PM1a(见WO92/19759)导入的CHO细胞中制备mRNA。通过获得的mRNA，用RT-PCR法克隆包含人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA，然后亚克隆到质粒pUC19的HindIII-BamHI位点。确定亚克隆质粒的DNA序列，具有正确碱基序列的质粒被指定为“pRVh-PM1f-cDNA”。
制备了具有SV40启动子和DHFR基因之间HindIII位点缺失和EF-1α启动子和人源化PM1抗体H链V区之间EcoRI位点缺失的表达载体，用于构建包含人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的表达载体。
获得的质粒pRVh-PM1f-cDNA用BamHI消化，用Klenow片段使末端平齐化，进一步用HindIII消化，从而获得平端HindIII-BamHI片段。这种平端HindIII-BamHI片段分别连接到上述已经用HindIII和BamHI消化的HindIII位点和BamHI位点缺失的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f上以构建包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的表达载体RVh-PM1f-cDNA。
包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的表达载体RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化，从其中收集包含H链V区的DNA片段。得到的DNA片段导入上述用ApaI和BamHI消化过的质粒MBC1Hv/pUC19中。如此制备的质粒被指定为“MBC1HcDNA/pUC19”。这种质粒是分别包含编码鼠抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的质粒，并具有5’端EcoRI-和HindIII-识别序列以及3’端BamHI-识别序列。
质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得编码嵌合抗体H链的DNA。得到的DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化的表达载体pCOS1中。这样获得的编码嵌合抗体的表达载体指定为“MBC1HcDNA/pCOS1”。其中，用EcoRI和SamI消化使HEF-PMh-gγ1(见WO92/19759)抗体基因缺失，然后将它连接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo)上，以构建表达载体pCOS1。
为制备在CHO细胞中表达的质粒，质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得编码嵌合抗体H链的DNA，然后其被导入预先用EcoRI和BamHI消化的表达质粒pCHO1中。这样获得的编码嵌合抗体的表达质粒指定为“MBC1HcDNA/pCHO1”。其中，用EcoRI和SamI消化使DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(见WO92/19759)抗体基因缺失，然后将它连接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo)上，以构建表达载体pCHO1。
(2)人L链C区的构建(i)克隆载体的制备为构建包含人L链C区的pUC19载体，制备了HindIII位点缺失的pUC19载体。2μg的pUC19载体用20μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)反应液于37℃消化1小时。得到的消化混合液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集感兴趣的DNA。
收集到的DNA在50μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM NaCl，0.5mM dNTP和6U Klenow片段(GIBCO BRL)的反应液中室温反应20分钟以钝化DNA末端。这种反应混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀收集载体DNA。
这样收集到的载体DNA在10μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，5％(v/v)聚乙二醇-8000，和0.5U T4DNA连接酶(GIBCO BRL)的反应液中16℃反应2小时以使载体DNA自主连接。5μl反应液加入100μl包含感受态大肠杆菌JM109(NipponGene)细胞的溶液中，得到的溶液冰上静置30分钟，42℃反应1分钟，进一步置于冰上1分钟。反应溶液中加入了500毫升SOC培养基，37℃培养1小时。得到的溶液在表面添加X-gal和IPTG的2xYT琼脂培养基(包含50μg/毫升的氨苄青霉素)上铺板(分子克隆实验室手册，Sambrook，等，Cold Spri纳克Harbor Laboratory Press，1989)，然后37℃培养过夜，由此获得转化体。
转化体在包含50μg/毫升的氨苄青霉素的2xYT琼脂培养基中37℃培养过夜。从培养基的细胞碎片用质粒Mini试剂盒(QIAGEN)按照试剂盒上的介绍纯化质粒DNA。纯化的质粒用HindIII消化。明确具有HindIII位点缺失的质粒指定为“pUC19ΔHindIII”。
(ii)编码人L链λ链C区DNA的构建已经知道人抗体L链λ链C区具有至少四种同种型包括Mcg+Ke+Oz-，Mcg-Ke-Oz-，Mcg-Ke-Oz+和Mcg-Ke+Oz-(P.Dariavach，等，美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)。基于EMBL数据库检索与#23-57-137-1鼠L链λ链C区同源的人抗体L链λ链C区。结果发现人抗体L链λ链的同种型Mcg+Ke+Oz-(登记号为X57819)(P.Dariavach，等，美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)表现与#23-57-137-1鼠L链λ链C区最高的同源性，氨基酸序列为64.4％的同源性，DNA序列为73.4％的同源性。
然后，用PCR法构建编码人抗体L链λ链C区的DNA。下列使用的每种引物均通过394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。合成的引物HLAMB1(SEQ ID NO11)和HLAMB3(SEQ ID NO13)均具有有义DNA序列，引物HLAMB2(SEQ ID NO12)和HLAMB4(SEQ ID NO14)均具有反义DNA序列，每种引物的两个末端均包含长度为20-23碱基对的互补序列。
外部引物HLAMBS(SEQ ID NO15)和HLAMBR(SEQ ID NO16)分别具有与引物HLAMB1和HLAMB4互补的序列，并分别包含EcoRI-，HindIII-和BlnI-识别序列和EcoRI-识别序列。第一次PCR反应中进行了HLAMB1-HLAMB2和HLAMB3-HLAMB4反应。反应完成后，这两种生成物等量混合，然后进入第二次PCR反应。反应物中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR。反应混合物进行第三PCR反应用于扩增全长DNA。
PCR反应用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)按照生产商的程序进行。第一次PCR反应中，使用了100μl包含5pmole HLAMB1，0.5pmoleHLAMB2和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液或者包含0.5pmole HLAMB3，5pmole HLAMB4和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行5次，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。第二次PCR反应中，使用每种反应液50μl混合，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应的3个循环利用，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟进行。第三次PCR反应中，反应液加入外部引物HLAMBS和HLAMBR各50pmole，PCR反应进行30个循环，利用温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第三次PCR反应获得的DNA片段用3％低熔点琼脂糖凝胶(NuSieve GTG Agarose，FMC)进行电泳，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上介绍的程序从凝胶收集和纯化。
这样获得的DNA片段在20μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM NaCl，和8U EcoRI(Takara Shuzo)的反应液中37℃反应1小时。消化液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀由此获得DNA。收集DNA并溶解于8μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
0.8μg的质粒pUC19ΔHindIII用EcoRI按照上述同样方式消化。消化液用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，获得消化的质粒pUC19ΔHindIII。这样消化获得的质粒在50μl包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM MgCl2，和碱性磷酸酶(大肠杆菌C75；Takara Shuzo)的反应液中37℃反应30分钟以使质粒脱磷酸化(即，BAP-处理)。反应液用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀获得DNA。这样获得的DNA溶解于10μl含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
这样制备的BAP-处理的质粒pUC19ΔHindIII 1μl与4μl上述PCR反应获得的DNA混合，利用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将二者连接起来。得到的质粒导入感受态大肠杆菌，JM109细胞形成转化体。转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞中的质粒。
对于上述质粒，确定了克隆DNA的序列。确定DNA序列时，使用了373A DNA测序仪(ABI)和引物“M13引物M4”和“M13引物RV”(Takara Shuzo)。结果发现克隆DNA中具有长度为12碱基对的缺失部分。包含该DNA的质粒指定为“CλΔ/pUC19”。然后，为了弥补这一部分，重新合成了引物、HCLMS(SEQ ID NO17)和HCLMR(SEQ ID NO18)，并且通过PCR法重新构建了正确的DNA。
用包含缺失DNA的质粒cλΔ/pUC19作为模版以及引物HLAMBS和HCLMS或引物HCLMS和HLAMB4进行了第一次PCR反应。分别纯化每一个PCR反应产物。在第二次PCR反应中，PCR产物彼此混合。产物中加入外部引物HLAMBS和HLAMB4，随后进行第三次PCR反应，以扩增全长DNA。
第一次PCR反应中，使用了100μl包含0.1μg cλΔ/pUC19作为模版，各50pmole引物HLAMBS和HCLMR或者各50pmole引物HCLMS和HLAMB4，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
PCR产物，HLAMBS-HCLMR(236碱基对)和HCLMS-HLAMB4(147碱基对)用3％低熔点琼脂糖凝胶进行电泳分离DNA片段。然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化DNA片段。第二次PCR反应中，使用了20μl包含40纳克纯化的DNA片段和1U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用25μl矿物油覆盖，以温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟进行5个循环。
第三次PCR反应中，使用了100μl包含2μl第二次PCR反应得到的反应液，外部引物HLAMBS和HLAMB4各50pmole，以及5UTaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟，由此得到长度为357碱基对的DNA片段(第三次PCR产物)。用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。用GENECLEANII试剂盒(BIO101)收集和纯化产生的DNA片段。
0.1μg这样获得的DNA片段用EcoRI消化，然后亚克隆到预先用BAP处理过的质粒pUC19ΔHindIII中。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞形成转化体。这样制备的转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo)在373A DNA测序仪(ABI)确定了如此获得的质粒的DNA序列。明确具有无任何缺失的正确DNA序列的质粒指定为“Cλ/pUC19”。
(iii)编码人L链κ链C区DNA的构建用PCR法从质粒HEF-PM1k-gk(WO92/19759)克隆了编码L链κ链C区的DNA片段。正向引物HKAPS(SEQ ID NO19)EcoRI-和HindIII-以及BlnI-识别序列，反向引物HKAPA(SEQ ID NO20)设计为包含设计为包含EcoRI-识别序列，二者均使用394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。
用100μl包含0.1μg质粒HEF-PM1k-gk作为模版，各50pmole引物HKAPS和HKAPA，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液进行PCR反应，液面覆盖50μl矿物油。PCR反应进行30个循环，其中利用了温度循环为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟，由此得到长度为360碱基对的DNA片段。DNA片段用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)收集和纯化。
这样获得的DNA片段用EcoRI消化，然后克隆到已经用BAP处理过的质粒pUC19ΔHindIII中。得到的质粒导入感受态大肠杆菌，JM109细胞形成转化体。这样制备的转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
纯化的质粒DNA用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo)在373A DNA测序仪(ABI)测序。明确具有正确碱基序列的质粒指定为“Cκ/pUC19”。
(3)嵌合抗体L链表达载体的构建构建了嵌合#23-57-137-1抗体L链表达载体。编码#23-57-137-1抗体L链V区的DNA连接到各个质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19人抗体C区之前的HindIII和BlnI位点，由此得到包含编码嵌合#23-57-137-1抗体L链V区和L链λ或κ链C区DNA的pUC19载体。然后用EcoRI消化每种得到的载体以便切出编码嵌合抗体L链的DNA，该DNA亚克隆到HEF表达载体中。
用PCR法从质粒MBC1L24克隆编码#23-57-137-1抗体L链V区的DNA。用394DNA/RNA合成仪(ABI)单独合成引物。使用的反向引物MBCCHL1(SEQ ID NO21)设计为包含Hind III-识别序列和Kozak序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)，正向引物MBCCHL3(SEQ ID NO22)设计为包含BglII-和RcoRI-识别序列。
用100μl包含10mM Tris-HCl(pH 8-3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.2mM dNTP，0.1μgMBC1L24，引物MBCCHL1和MBCCHL3各50pmole，以及1μl AmpliTaq(PERKIN ELMER)的反应液进行PCR反应，液面覆盖50μl矿物油。PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出长度为444碱基对的DNA片段，然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)收集和纯化。纯化的DNA片段溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。1μl PCR产物在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和8U EcoRI(TakaraShuzo)的反应液中37℃消化1小时。消化液用苯酚氯仿提取，随后用乙醇沉淀收集沉淀DNA。如此获得的DNA溶解于8μl包含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
1μg的质粒pUC19用HindIII和EcoRI按照上述同样方式消化。然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀收集消化的质粒。产物用BAP(即，碱性磷酸盐(大肠杆菌C75；Takara Shuzo))处理，然后用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀获得DNA。这样获得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-处理的质粒pUC191μl与4μl上述PCR产物混合，用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将二者连接起来。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞(Nippon Gene)，以上述同样的方式形成转化体。转化体在含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT琼脂培养基上37℃培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞碎片中的质粒。DNA测序后，明确具有正确DNA序列的质粒指定为“CHL/pUC19”。
各1μg质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19分别在20μl包含20mMTris-HCl(pH 8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2U BlnI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。消化液用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，由此获得DNA。DNA用BAP在37℃处理30分钟，然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀。产物溶解于10μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
8μg包含编码#23-57-137-1L链V区DNA的质粒CHL/pUC19用HindIII和BlnI以上述同样方式消化。利用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳获得长度为409碱基对的DNA片段，然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化该DNA片段。DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
4μl L链V区的DNA分别亚克隆到1μl BAP-处理的质粒Cλ/pUC19或Cκ/pUC19上，然后导入感受态大肠杆菌，JM109细胞形成转化体。转化体在3毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)分离和纯化细胞碎片中的质粒。由此制备的质粒分别指定为“MBC1L(λ)/pUC19”和“MBC1L(κ)/pUC19”。
质粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19分别用EcoRI消化，然后用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳。用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中分离和纯化长度743碱基对的DNA片段，并将该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
2.7μg的表达载体，质粒HEF-PM1k-gk用EcoRI消化，然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，由此获得DNA片段。DNA片段用BAP处理，然后用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳。用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中分离和纯化到长度为6561碱基对的DNA片段。该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
这样制备的HEF载体用BAP处理，2μl BAP-处理的HEF载体与3μl质粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19的EcoRI片段混合，以使彼此连接。连接产物导入感受态大肠杆菌，JM109细胞形成转化体。转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2×YT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞碎片中的质粒。
这样纯化的质粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2UPvuI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。在这一消化反应中，推测如果上述DNA片段正向插入载体，则得到5104/2195碱基对的消化片段，如果上述DNA片段反向插入载体，则得到4387/2926碱基对的消化片段。基于这种推测，正向插入片段的质粒分别指定为“MBC1L(λ)/neo”和“MBC1L(κ)/neo”。
(4)COS-7细胞的转染上述制备的表达质粒分别用COS-7细胞短暂表达以便评价嵌合抗体对抗原的结合和中和活性。
通过Gene Pulser(Bio Rad)电穿孔将质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(λ)/neo或者质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(κ)/neo结合进行嵌合抗体的短暂表达以便将这些质粒DNA的组合物共转染到COS-7细胞中。即，共转染到0.8毫升细胞悬浮液中，其中COS-7细胞悬浮于PBS(-)，浓度为1×107个细胞/毫升，并加入每种质粒DNA各10μl。得到的溶液应用1500V和2μF静电容量的脉冲进行电穿孔。室温恢复10分钟后，细胞悬浮于包含2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，然后用10cm的培养皿在CO2培养箱种培养。培养72小时后，收集培养上清液，离心除去细胞碎片，以此作为ELISA分析的样品。
该程序中，嵌合抗体从COS-7细胞上清液中的纯化通过AffiGelProtein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)按照试剂盒上介绍的方法进行。
(5)ELISA分析(i)抗体浓度的确定确定抗体浓度的ELISA平板如下制备。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每个孔都用100μl包含包被缓冲液(0.1MNaHCO3，0.02％NaN3)中制备的浓度为1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的溶液包被，然后用200μl稀释缓冲液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH 7.2]隔断。每孔加入其中嵌合抗体得以表达的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化嵌合抗体。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)用作该测定的标准品。
(ii)抗原结合能力的确定确定抗原结合能力的ELISA平板如下制备。用于ELISA分析的96孔平板的每个孔都用100μl包含包被缓冲液中制备的浓度为1μg/毫升的人PTHrP(1-34)(肽研究所)的溶液包被，然后用200μl稀释缓冲液隔断。每孔加入其中嵌合抗体得以表达的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化嵌合抗体。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)溶液。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。
结果发现嵌合抗体具有对人PTHrP(1-34)的结合能力，也具有克隆的鼠抗体V区(图4)的正确结构。还发现L链C区有λ链的嵌合抗体和L链C区有κ链的嵌合抗体对PTHrP(1-34)的结合能力没有差异。因此，通过人源化抗体L链λ链构建了人源化抗体L链C区。
(6)CHO稳定转化细胞系的建立为了建立产生嵌合抗体的稳定转化体，上述表达质粒导入CHO细胞(DXB11)。
嵌合抗体稳定转化体的建立通过CHO细胞的表达质粒、质粒MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(λ)/neo结合或者CHO细胞的表达质粒、MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(κ)/neo结合实现。这些质粒组合体通过Gene Pulser(Bio Rad)电穿孔分别共转染到CHO细胞中。每种表达载体用限制性酶PvuI切开成为线型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取并用乙醇沉淀收集。这样制备的质粒DNA分别电穿孔。质粒DNA各10μg加入0.8毫升包含CHO细胞(浓度为1×107个细胞/毫升)的PBS(-)细胞悬浮液中。得到的混合液应用静电容量为1500V和2μF的脉冲进行电穿孔。室温恢复10分钟后，电穿孔的细胞悬浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培养基中。得到的悬浮液用三个96孔平板(Falcon)在CO2培养箱中培养。培养当天，培养基用选择性培养基[添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(G418Sulfate；GIBCO)无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM-α培养基]替换。从培养基中选择导入抗体基因的细胞。新鲜培养基替换选择性培养基后，显微镜下观察开始培养之前的细胞和培养2周后的细胞。当观察到细胞生长时，用上述ELISA分析法确定产生的抗体量。选择性收集产生大量抗体的细胞。
已建立抗体稳定转化体在摇瓶中用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清，无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM培养基大规模培养。培养第3到4天，收集培养基上清液，然后用孔径为0.2μm(Millipore)的滤器过滤以除去其中的细胞碎片。
随后，用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millipore)上按照其上介绍的方法纯化CHO细胞培养上清液中的嵌合抗体。纯化的嵌合抗体作为确定中和活性和检验对高钙血症模型动物的效能的样品。纯化嵌合抗体抗原的浓度和结合活性用同样的ELISA系统确定。
实施例3人源化抗体的构建(1)人源化抗体H链的构建(i)人源化H链V区的构建通过PCR法用CDR-移植技术制备人源化#23-57-137-1抗体H链。为制备具有来源于人抗体S31679(NMRF-PDB；Cuisinier，A.M.等，欧洲免疫杂志，23，110-118，1993)FR的人源化#23-57-137-1抗体H链(“a”型)使用了下列六种类型PCR引物CDR-移植引物MBC1HGP1(SEQ ID NO23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO24)(均包含有义DNA序列)以及MBCHGP2(SEQ ID NO25)和MBC1HGP4(SEQID NO26)(均包含反义DNA序列)，它们的每个末端均包含长度为15-21碱基对的互补序列；以及外部引物MBC1HVS1(SEQ ID NO27)和MBC1HVR1(SEQ ID NO28)，它们分别具有与CDR-移植引物MBC1HGP1和MBC1HGP4的同源性。
CDR-移植引物MBC1HGP1、MBCHGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4按照下列方式用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶(分子克隆实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)分离，并用压碎浸泡法(分子克隆实验室手册，Sambrook等，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)从凝胶片段中提取。
每种CDR-移植引物各1nmole用6％变性聚丙烯酰胺凝胶分离得到DNA片段。用UV照射硅胶薄层平板从产物DNA片段中鉴定需要长度的DNA片段，然后用压碎浸泡法收集。产物溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。用TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo)进行PCR反应。用于PCR反应的反应液(100μl)包含上述CDR-移植引物MBC1HGP1、MBCHGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4各1μl，0.25mM dNTP和2.5U TaKaRa Ex Taq的缓冲液。PCR反应进行5个循环，其中利用温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。外部引物MBC1HVS1和MBC1HVR1各50pmole加入反应混合物。利用这种反应混合物再用同样的温度循环进行PCR反应另外30个循环。这样扩增得到的DNA片段用4％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下包含长度为421碱基对DNA片段的琼脂糖片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化DNA片段。纯化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。获得的PCR反应混合物用于将DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上；随后确定得到质粒的碱基序列。具有正确序列的质粒指定为“hMBCHv/pUC19”。
(ii)用于人源化H链cDNA的H链V区的构建为了连接到人源化H链C区Cγ1的cDNA上，上述步骤构建的人源化H链V区的DNA用PCR法修饰。该方法中，使用的反向引物MBC1HVS2设计为可以与编码V区引导序列5’-末端区的序列杂交并携带Kozak共有序列(Kozak等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)以及HindIII-和EcoRI-识别序列。用于修饰H链V区DNA的正向引物MBC1HVR2设计为可以与编码J区3’-末端区的DNA序列和编码C区5’-末端区的DNA序列杂交并携带ApaI-和SamI-识别序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)进行PCR反应，随其应用了缓冲液。用于PCR反应的反应液为包含0.4μghMBCHv/pUC19作为DNA模版，MBC1HVS2和MBC1HVR2各50pmole作为引物，2.5U TaKaRaEx Taq和缓冲液中的0.25mM dNTP。PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。这样由PCR法扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下长度为456碱基对的DNA片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法从中纯化DNA片段。纯化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mMEDTA的溶液中。获得的PCR反应混合物用于DNA片段亚克隆到预先用EcoRI和SamI消化的质粒pUC19上；随后确定得到质粒的碱基序列。由此制备的包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的DNA和也包含5’-末端区HindIII-和EcoRI-识别序列和Kozak序列以及3’-末端区ApaI-和SamI-识别序列的质粒DNA指定为“hMBC1Hv/pUC19”。
(2)人源化抗体H链表达载体的构建包含hPM1抗体H链的cDNA序列的质粒RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化以获得包含H链C区碱基序列的DNA片段。该DNA片段导入预先用ApaI和BamHI消化过的质粒hMBC1Hv/pUC19上。由此制备的质粒指定为“hMBC1HcDNA/pUC19”。该质粒包含编码人源化#23-57-137-1抗体H链V区的DNA和编码人H链C区Cγ1的DNA并具有5’-末端区HindIII-和EcoRI-识别序列以及3’-末端区BamHI-识别序列。质粒hMBC1HcDNA/pUC19中包含的人源化H链“a”型的碱基序列和对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO58和SEQID NO56所示。
质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得包含编码H链碱基序列的DNA片段。将该DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化过的表达质粒pCOS1上。获得的人源化抗体的表达质粒指定为“hMBC1HcDNA/pCOS1”。
为制备在CHO细胞中表达的质粒，质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得包含编码H链DNA的DNA片段。该DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化过的表达载体pCHO1上。由此获得的人源化抗体的表达质粒指定为“hMBC1HcDNA/pCHO1”。
(3)L链杂合可变区的构建(i)FR1、2/FR3、4杂合抗体的制备构建了编码其中FR区与人源化抗体和鼠(嵌合)抗体FR区重组的L链的DNA，并评价了该区人源化作用的适宜性。该步骤中，包含来源于人抗体的FR1和FR2以及来源于鼠抗体的FR3和FR4的抗体利用存在于CDRZ中的AflII限制性位点制备。
质粒MBC1L(λ)/neo和hMBC1L(λ)/neo各10μg在100μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA和10U Afl II(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。反应液用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为6282碱基对的DNA片段(称为“c1”)和长度为1022碱基对的DNA片段(称为“h1”)。
获得的c1和h1片段各1μg用BAP处理。用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀收集DNA片段，然后溶于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-处理的c1和h1DNA片段各1μl分别与4μl h2和c2DNA片段混合，以使彼此连接(4℃过夜)。连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含50μg/毫升胺苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
纯化的质粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，2U ApaLI(Takara Shuzo)，和8U BamHI(TakaraShuzo)或HindIII(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。该步骤中，基于这样的设想鉴定了质粒，即如果c1-h2片段正确连接到质粒上，该连接获得5560/124/498碱基对的ApaLI消化片段或者7134/269碱基对的BamHI/HindIII消化片段。
编码人FR1、2/鼠FR3、4杂合抗体L链的表达载体指定为“h/mMBC1L(λ)/neo”。另一方面，没有获得h1-c1的克隆。因此，在pUC载体上进行了重组，随后克隆到HEF载体上。其中，用做模版的是包含编码无氨基酸替换的人源化抗体L链V区DNA的质粒hMBC1Laλ/pUC19，和包含编码FR3中第91位(即，按照Kabat定义的87号氨基酸)酪氨酸由异亮氨酸取代的人源化抗体L链V区DNA的质粒hMBC1Ldλ/pUC19。
质粒MBC1L(λ)/pUC19、hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19各10微升在30μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA，16U HindIII和4U Afl II的反应液中37℃消化1小时。反应液用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从质粒MBC1L(λ)/pUC19中收集和纯化下面DNA片段长度为215碱基对的DNA片段(称为“c2”)或者分别从质粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19中收集和纯化长度为3218碱基对的DNA片段(分别称为“ha1”和“hd1”)。
每种ha1’和hd1’片段分别连接到c2’片段上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含50μg/毫升胺苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。得到的包含hal’片段和hdl’片段的质粒DNA分别指定为“m/hMBC1Laλ/pUC19”和“m/hMBC1Ldλ/pUC 19”。
质粒m/hMBC1Laλ/pUC19和m/hMBC1Ldλ/pUC19分别用EcoRI消化。2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为743碱基对的DNA片段。产物溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
获得的DNA片段4μl与上述BAP-处理的HEF载体1μl混合以彼此连接。连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含50μg/毫升胺苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒DNA。
纯化的质粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2UPvuI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。该步骤中，基于这样的设想鉴定了质粒DNA，即如果DNA片段正向插入质粒，该连接反应得到5104/2195碱基对的消化片段，而如果DNA片段反向插入质粒，该连接反应得到4378/2926碱基对的消化片段。由此获得的质粒是编码鼠FR1、2/人FR3、4杂合抗体L链的表达载体分别指定为表达载体“m/hMBC1Laλ/neo”和“m/hMBC1Ldλ/neo”。
(ii)FR1/FR2杂合抗体的制备按照上述同样的方式利用存在于CDR1中SnaBI限制性位点制备FR1/FR2杂合抗体。
质粒MBC1L(λ)/neo和mMBC1L(λ)/neo各10μg在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA，和6U SnaBI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。得到反应液进一步在50μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，0.01％(w/v)BSA，和6U PvuI的反应液中37℃消化1小时。
得到的反应液用1.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为4955碱基对和2349碱基对的DNA片段。从质粒MBC1L(λ)/neo中获得的DNA片段指定为“m1”(4955碱基对)和“m2”(2349碱基对)，从质粒h/mMBC1L(λ)/neo中获得的DNA片段指定为“hm1”(4955碱基对)和“hm2”(2349碱基对)。获得的每种DNA片段均溶于20μl含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
m1和hm1片段各1μl分别连接到hm2和m2片段各4μl上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。获得的转化体在2毫升包含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprepSpin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒DNA。
纯化的质粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，和8U ApaI(Takara Shuzo)或者2U ApalI(TakaraShuzo)的反应液中37℃消化1小时。
基于下述设想鉴定了由此制备的质粒(m1-hm2和hm1-m2)，即如果每种DNA片段以正确方向连接到质粒上，用ApaI和ApaLI消化的质粒(m1-hm2)将分别得到7304碱基对的消化片段和5560/1246/498碱基对的消化片段，用ApaI和ApaLI消化的质粒(hm1-m2)将分别得到6538/766碱基对的片段和3535/2025/1246/498碱基对的片段。
编码人FR1/鼠FR2、3、4杂合抗体L链的表达载体指定为“hmmMBC1L(λ)/neo”，编码鼠FR1/人FR2/鼠FR3、4杂合抗体L链的表达载体指定为“mhmMBC1L(λ)/neo”。
(4)人源化抗体L链的构建通过PCR法用CDR-移植技术制备了人源化#23-57-137-1抗体L链。即，包含来源于人抗体HSU03868(GEN-BANK，Deftos M.等，Scand.免疫学杂志，39，95-103，1994)FR1、FR2、FR3以及来源于人抗体S25755(NBRF-PDB)FR4的人源化#23-57-137-1抗体L链(“a”型)用下述六种类型的PCR引物制备具有有义DNA序列的CDR-移植引物MBC1LGP1(SEQ ID NO29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO30)，具有反义DNA序列的CDR-移植引物MBC1LGP2(SEQ ID NO31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO32)，所有这些CDR-移植引物的每个末端都具有15-21碱基对的互补序列；以及分别与CDR-移植引物MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO33)和MBC1LVR1(SEQ ID NO34)。
CDR-移植引物MBC1LGP1、MBCLGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶分离(分子克隆实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用压碎浸泡法从凝胶片段中提取(分子克隆实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
每种CDR-移植引物各1nmole用6％变性聚丙烯酰胺凝胶分离。UV射线照射的硅胶薄层平板鉴定需要长度的DNA片段，然后用压碎浸泡法从中收集。产物溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mMEDTA的溶液中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液(100μl)包含CDR-移植引物MBC1LGP1、MBCLGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4各1μl，0.25mM dNTP，缓冲液中的2.5UTaKaRa Ex Taq。PCR反应进行5个循环，其中利用了温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。反应混合物中加入外部引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole。利用这种反应混合物再用同样的温度循环进行PCR反应另外30个循环。这样扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下包含长度为421碱基对DNA片段的琼脂糖片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化DNA片段。由此制备的PCR反应混合物用于DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上。确定得到质粒的DNA序列。由此制备的质粒指定为“hMBCL/pUC19”。然而发现该质粒CDR4的第104位氨基酸(按照Kabat确定的96号氨基酸)由精氨酸取代。为了将这个氨基酸校正为酪氨酸，设计和合成了引物MBC1LGP10R(SEQ ID NO35)。然后用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)和缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液(100μl)包含0.6μg的质粒hMBCL/pUC19为模版DNA，引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole，2.5U TaKaRaEx Taq(Takara Shuzo)，和缓冲液中的0.25mM dNTP，液面覆盖矿物油。PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。这样扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下长度为421碱基对的DNA片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化DNA片段。由此制备的PCR反应混合物用于该DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上。
用M13引物M4和M13引物RV确定该质粒的DNA序列。结果确定该质粒具有正确的序列。然后该质粒用HindIII和BlnI消化，用1％的琼脂糖凝胶电泳从中分离到416碱基对的DNA片段。DNA片段用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化。然后导入预先用HindIII和BlnI消化的质粒Cλ/pUC上。得到的质粒指定为“hMBC1Laλ/pUC19”。该质粒用EcoRI消化，得到编码人源化L链的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1以至人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。这样获得的质粒指定为“hMBC1Laλ/pCOS1”。人源化L链“a”型的DNA序列(包括对应氨基酸序列)如SEQ ID NO66所示。“a”型的氨基酸序列如SEQ ID NO47所示。
“b”型通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“b”型是为了用脯氨酸替换43位的甘氨酸(Kabat定义的43号氨基酸)并用天冬氨酸替换49位的赖氨酸(Kabat定义的49号氨基酸)。用质粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突变引物MBC1LGP5R(SEQ ID NO36)和引物MBC1LVS1进行PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，消化片段亚克隆到pUC19的BamHI-HindIII位点。测序后，获得的质粒DNA用HindIII和AflII消化，产生的消化片段连接到预先用HindIII和AflII消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。
由此获得的质粒指定为“hMBC1Lbλ/pUC19”。该质粒DNA用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒指定为“hMBC1Lbλ/pCOS1”。
“c”型通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“c”型是为了用脯氨酸替换84位的丝氨酸(Kabat定义的80号氨基酸)。用质粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突变引物MBC1LGP6S(SEQ ID NO37)和引物M13引物RV进行PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化过的pUC19上。测序后，获得的质粒DNA用BstPI和Aor51HI消化，产生的DNA片段连接到预先用BstPI和Aor51HI消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。由此获得的质粒指定为“hMBC1Lcλ/pUC19”。该质粒DNA用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的DNA片段。该序列导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒指定为“hMBC1Lcλ/pCOS1”“d”、“e”、“f”型也通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“d”、“e”、“f”型是为了在91位分别用“a”、“b”、“c”型的异亮氨酸替换酪氨酸(Kabat定义的87号氨基酸)。分别用质粒hMBC1Laλ/pCOS1作为“d”型的模版，质粒hMBC1Lbλ/pUC19作为“e”型的模版，质粒hMBC1Lcλ/pUC19作为“f”型的模版，用突变引物MBC1LGP11R(SEQ ID NO38)和引物M-S1(SEQ ID NO44)分别进行“d”、“e”、“f”各型的PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化过的pUC19上。测序后，质粒用HindIII和BlnI消化，产生的消化片段连接到预先用HindIII和BlnI消化过的质粒Cλ/pUC19上。
由此获得的质粒分别指定为“hMBC1Ldλ/pUC19”、“hMBC1Leλ/pUC19”和“hMBC1Lfλ/pUC19”。每种质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于该质粒EF1α启动子的下游。由此获得的质粒分别指定为“hMBC1Ldλ/pCOS1”，“hMBC1Leλ/pCOS1”和“hMBC1Lfλ/pCOS1”。
“g”、“h”型也通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“g”、“h”型是为了在36位分别用“a”和“d”型的酪氨酸替换组氨酸(Kabat定义的36号氨基酸)。用突变引物MBC1LGP9R(SEQ ID NO39)和引物M13引物RV，并用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版进行PCR反应。PCR产物用M13引物M4作为引物以及质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版再次进行另一个PCR反应。获得的DNA片段用HindIII和BlnI消化，然后继代克隆到预先用HindIII和BlnI消化过的质粒Cλ/pUC19上。用该质粒作为模版，用引物MBC1LGP13R(SEQ ID NO40)和MBC1LVS1再次进行PCR反应。获得的PCR片段用ApaI和HindIII消化，然后分别导入预先用ApaI和HindIII消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19上。确定获得的质粒的DNA序列。明确含有正确序列的质粒分别指定为“hMBC1Lgλ/pUC19”和“hMBC1Lhλ/pUC19”。每种质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的序列。该序列导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒分别指定为“hMBC1Lgλ/pCOS1”和“hMBC1Lhλ/pCOS1”。
“i”、“j”、“k”、“l”、“m”、“n”、“o”型也通过PCR法用诱变导入技术制备。用突变引物MBC1LGP14S(SEQ ID NO41)和引物V1RV(λ)(SEQ ID NO43)，并用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版进行PCR反应。产生的DNA片段用ApaI和BlnI消化，然后亚克隆到预先用ApaI和BlnI消化过的质粒hMBC1Lgλ/pUC19上。确定获得的质粒的碱基序列，对应每种类型导入突变的克隆。由此获得的质粒指定为“hMBC1Lxλ/pUC19(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。该质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的序列。该序列导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒指定为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。“j”、“l”、“m”、和“o”型的DNA序列(包括对应的氨基酸序列)分别如SEQ ID NO67、68、69和70所示。这些类型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO48、49、50和51所示。
“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型分别是“i”、“j”、“m”、“l”和“o”型的87位酪氨酸被异亮氨酸替代的修饰型。这些类型按照下列方式利用FR3中的Aor51MI限制性位点用“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型替换“h”型制备。从表达质粒hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，m，l，或o)中缺失包含CDR3的Aor51HI限制性片段(514碱基对)、部分FR3和全部FR4。包含CDR3的Aor51HI限制性片段(514碱基对)、部分FR3和全部FR4连接到表达质粒的缺失部分上，从而用异亮氨酸替换了91位的酪氨酸(Kabat定义的87号氨基酸)。确定产生的质粒的DNA序列，选择91位酪氨酸(Kabat定义的87号氨基酸)被异亮氨酸替换的各种“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型克隆。对应于“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型的类型分别指定为“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型，这些类型的质粒指定为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝p，q，s，r或t)”。“q”、“r”、“s”和“t”型的DNA序列(包括对应的氨基酸序列)分别如SEQ ID NO71、72、73、74所示。这些类型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO52、53、54、55所示。
质粒hMBC1Lqλ/pCOS1用HindIII和EcoRI消化，然后亚克隆到预先用HindIII和EcoRI消化的质粒pUC19上。获得的质粒指定为“hMBC1Lqλ/pUC19”。
每种人源化L链类型中取代氨基酸的位置如表3所示。
表3序列表中取代氨基酸的位置(按照Kabat定义的氨基酸编号)

上表3中，大写字母代表下列氨基酸Y酪氨酸；P脯氨酸；K赖氨酸；V缬氨酸；D天冬氨酸；I异亮氨酸。
包含质粒hMBC1HcDNA/pUC19的大肠杆菌株系和包含质粒hMBC1Lqλ/pUC19的大肠杆菌株系分别指定为“大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)”和“大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)”，它们已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国家生物科学和人类技术所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)的登记号为FERM BP-5629，大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的登记号为FERM BP-5630。
(5)转染到COS-7细胞为确定杂合抗体和人源化#23-57-137-1抗体的抗原结合活性和中和活性，上述表达质粒在COS-7细胞中短暂表达。为短暂表达杂合抗体L链，下列各质粒的组合用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔共转染COS-7细胞hMBC1HcDNA/pCOS1和h/mMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Laλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Ldλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和hmmMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和mhmMBC1L(λ)/neo。即，各质粒DNA 10微克加入0.8毫升COS-7细胞悬浮于PBS(-)浓度为1×107个细胞/毫升的细胞悬浮液。得到的溶液应用静电容量为1500V和25μF的脉冲。室温恢复10分钟，电穿孔处理的细胞悬浮于添加2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，然后用10cm的培养皿在CO2培养箱中培养。培养72小时后，收集培养上清液，并离心除去细胞碎片。产物作为ELISA分析的样品。
为实现人源化#23-57-137-1抗体的短暂表达，各质粒组合hMBC1HcDNA/pCOS1或hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝a-t)以上述杂合抗体同样的方式用Gene Pulser(Bio Rad)转染到COS-7细胞中。获得的培养上清液作为ELISA分析的样品。
其中，COS-7细胞培养上清液中的杂合抗体或人源化抗体用AffiGel Protein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)按照试剂盒上指示的方法进行纯化。
(6)ELISA分析(i)抗体浓度的确定确定抗体浓度的ELISA平板如下制备。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每个孔都用100μl添加1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3)包被，然后用200μl稀释缓冲液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH 7.2]隔断。每孔加入表达杂合抗体或人源化抗体的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化杂合抗体或人源化抗体溶液。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(BioRad)于405nm测量溶液的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)用作抗体浓度测定的标准品。
(ii)抗原结合能力的确定确定抗原结合能力的ELISA平板如下制备。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每个孔均用100μl添加1μg/毫升人PTHrP(1-34)的包被缓冲液包被，然后用200μl稀释缓冲液隔断。每孔加入杂合抗体或人源化抗体得以表达的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化杂合抗体或人源化抗体溶液。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。
(7)活性的确定(i)人源化H链的评价发现包含人源化H链“a”型和嵌合L链的抗体表现与嵌合抗体(见图5)同样水平的PTHrP结合活性。该结果表明“a”型成功地实现了H链V区的人源化。因此，人源化H链“a”型用做下列实验中的人源化抗体H链。
(ii)杂合抗体的活性(ii-a)FR1、2/FR3、4杂合抗体当L链为h/mMBC1Ld(λ)时，抗体不表现抗原结合活性。然而，当杂合抗体的L链为m/hMBC1Laλ或m/hMBC1Ldλ时，抗体表现与嵌合#23-57-137-1抗体同样水平的抗原结合活性(图6)。这些结果表明FR3和FR4适于人源化抗体，但FR1和FR2存在需要的一些氨基酸残基被替换。
(ii-b)FR1/FR2杂合抗体当杂合抗体的L链为mhmMBC1L(λ)时，抗体不表现抗原结合活性。然而，当杂合抗体的L链为hmmMBC1L(λ)时，抗体表现与嵌合#23-57-137-1抗体同样水平的抗原结合活性(图7)。这些结果表明FR1适于人源化抗体，但FR2存在需要的一些氨基酸残基被替换。
(iii)人源化抗体的活性确定了每种“a”型到“t”型用做L链的人源化抗体的抗原结合活性。结果发现，具有“j”，“l”，“m”，“o”，“q”，“r”，“s”和“t”型L链的人源化抗体表现与嵌合抗体同样水平的PTHrP-结合活性(图8-11)。
(8)CHO稳定生产细胞系的建立为建立人源化抗体的稳定转化体，上述表达质粒导入CHO细胞(DXB11)。
采用下列质粒的组合作为CHO细胞的表达载体建立了人源化抗体的稳定转化体hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lmλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lqλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lrλ/pCOS1。质粒用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔共转染到CHO细胞中。随后，每种表达载体用限制性酶PvuI裂解获得线型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀。制备的DNA分别如下述进行电穿孔。即，每种质粒DNA各10微克加入0.8毫升包括COS-7细胞悬浮于PBS(-)浓度为1×107个细胞/毫升的细胞悬浮液。得到的混合物应用静电容量为1500V和25μF的脉冲。恢复室温10分钟，电穿孔处理的细胞悬浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培养基(GIBCO)中，然后用96孔平板(Falcon)在CO2培养箱中培养。培养当天，用添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(硫酸G418；GIBCO)但无核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEM-α选择培养基替换原培养基。从培养基中筛选导入抗体基因的细胞。用新鲜培养基替换原培养基后，培养之前和之后两周，显微观察细胞。当观察到满意的细胞生长后，用如上述确定抗体浓度的常规ELISA分析法确定细胞产生的抗体量。选择性收集大量产生抗体的那些细胞。
用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清，无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM-α培养基在摇瓶中大规模培养这样建立的抗体的稳定转化体。培养后第3天和第4天收集培养基上清液，并用0.2μm的滤器(Millipore)过滤以除去其中的细胞碎片。CHO细胞培养上清液中的人源化抗体用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millopore)上按照包括于其中的指导进行纯化。该人源化抗体用做确定中和活性和检查对高钙血症模型动物药理效能的样品。用上述ELISA系统确定纯化的人源化抗体的浓度和抗原结合活性。
实施例4中和活性的确定鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的中和活性的测定通过大鼠骨髓瘤细胞系ROS17/2.8-5细胞进行。在CO2培养箱中，将ROS17/2.8-5细胞培养在添加10％胎牛血清(GIBCO)的Ham’s F-12培养基中，细胞浓度为104个细胞/100μl/孔，将ROS17/2.8-5细胞接种到用96孔平板的每孔中培养1天。培养基用添加4mM氢化可的松和10％胎牛血清的Ham’s F-12培养基(GIBCO)更换。培养三到四天后，培养细胞用260μl Ham’s F-12培养基(GIBCO)冲洗，然后其中加入80μl添加1mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，SIGMA)、10％胎牛血清和10mM HEPES的Ham’s F-12培养基。得到的混合物于37℃保温30分钟。
用于检测中和活性的鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体预先按照下列各组逐步稀释[10μg/毫升，3.3μg/毫升，1.1μg/毫升和0.37μg/毫升]，[10μg/毫升，2μg/毫升，0.5μg/毫升和0.01μg/毫升]和[10μg/毫升，5μg/毫升，1.25μg/毫升，0.63μg/毫升和0.31μg/毫升]。每种稀释的抗体样品溶液与等量4纳克/毫升PTHrP(1-34)混合。80μl得到的混合溶液加入各孔。每种抗体的终浓度为上述抗体浓度的四分之一，因此PTHrP(1-34)的浓度成为1纳克/毫升。室温处理十分钟后，除去培养上清液，残留物用PBS冲洗三次。从产物中用10μl 0.3％HCl-95％乙醇提取细胞中的cAMP，然后水蒸汽吸收器蒸发除去HCl-乙醇。残留物溶解于120μl吸附到cAMP EIA试剂盒(CAYMAN CHEMICAL’S)的EIA缓冲液中以提取其中的cAMP。用cAMP EIA试剂盒(CAYMANCHEMICAL’S)按照其中指示的方法确定cAMP的水平。结果发现，在具有与嵌合抗体表现同样水平抗原结合活性的L链型的人源化抗体中，具有在91位酪氨酸被异亮氨酸取代的“q”，“r”，“s”和“t”型L链人源化抗体表现与嵌合抗体最接近的中和活性，尤其L链为“q”型的人源化抗体表现最强的中和活性(图12-14)。
实施例5对高钙血症模型动物药理效能的检测(1)用高钙血症模型动物(人肿瘤移植的裸鼠)，分别检测了具有“m”，“r”和“q”型L链的抗PTHrP嵌合抗体和人源化抗体对高钙血症的治疗效能。
移植人胰腺癌PAN-7的裸鼠[从实验动物中心购买]用做高钙血症模型动物。已知移植人胰腺癌PAN-7的裸鼠随肿瘤体积的增加表现血钙浓度的增加，并形成与体重和自发活性(例如)降低有关的高钙血症。该实施例中，本发明的嵌合抗体和人源化抗体对人胰腺癌PAN-7诱导的高钙血症治疗效能通过受测动物的体重和血钙浓度测定而检测。
利用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)体内移植人胰腺癌PAN-7。为评价药理效能，购买了5周大的雄性BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)，然后使它们适应一周，这样，六周大的鼠用于上述评价实验。制备高钙血症模型鼠并将它们按照下列方式分组。切下人胰腺癌PAN-7，并精切成3mm的立方体。得到的肿瘤块移植到鼠皮瓣下，每只鼠移植一块。移植后两或三周，当确定每只鼠的肿瘤体积都足够大时，将鼠按照肿瘤体积、血钙浓度、和体重平均分组，这样鼠被用做高钙血症模型动物。
对高钙血症治疗效能的检测如下进行。具有“m”或“r”型L链的抗PTHrP嵌合抗体或人源化抗体给上述每只高钙血症模型鼠的尾静脉分别以单剂量10或30μg/鼠给药。具有“q”型L链的人源化抗体单剂量给上述每只高钙血症模型鼠的尾静脉以剂量20或60μg/鼠给药。给药后第1天、第4天、第7天和第11天分别测量每只鼠的血钙浓度和体重以评价抗体的治疗效能。肿瘤体积通过测量肿瘤的最大直径(a mm)和最小直径(b mm)并且按照Galant’s计算式[ab2/2]计算两次测量值确定。血钙浓度用血细胞比容管从每只鼠眼眶取血，并加到643自动Ca2+/pH分析仪(CIBA-CORNING)测定全血钙离子浓度作为血钙浓度。
结果发现具有“m”，“r”和“q”型L链的嵌合抗体和人源化抗体对受试体给药导致体重和血钙浓度的变化迅速改善以及延长期滞留的增加。该结果表明本发明的嵌合抗体和人源化抗体可用于治疗高钙血症相关恶性肿瘤(见图15和16)。
实施例6对高钙血症模型动物药理效能的检测(2)利用高钙血症模型动物(人肿瘤移植的裸鼠)如下述检测了具有“q”型L链的抗PTHrP嵌合抗体和人源化抗体对高钙血症的治疗效能。
对高钙血症的治疗效能如下检测。具有“q”型L链的抗PTHrP嵌合抗体或人源化抗体的单剂量给上述每只高钙血症模型鼠的尾静脉以剂量10或30μg/鼠给药。给药后第1天、第3天、第7天和第11天分别测量每只鼠的血钙浓度和体重以评价抗体的治疗效能。用血细胞比容管从每只鼠眼眶取血，并用643自动Ca2+/pH分析仪(CIBA-CORNING)测定全血钙离子浓度作为血钙浓度。
结果发现具有“q”型L链的嵌合抗体和人源化抗体对携带人胰腺癌PAN-7的高钙血症模型动物给药导致受体体重和血钙浓度的迅速改善以及延长期保留的增加。该结果表明本发明的嵌合抗体和人源化抗体是治疗高钙血症相关恶性肿瘤的有效药物(见图17)。
实施例7对高钙血症模型动物药理效能的检测(3)通过高钙血症模型动物(人肺癌LC-6移植的裸鼠)，检测了具有“q”型L链的抗PTHrP嵌合抗体和人源化抗体对高钙血症的治疗效能。
该实验中，移植了人肺癌LC-6移植的裸鼠(购买自实验动物中心)用作高钙血症模型动物。移植了已知人肺癌LC-6移植的裸鼠倾向于随肿瘤体积的增加表现血钙浓度随之增加，并形成与体重和自发活性有关的高钙血症。
该实施例中，通过测量受试动物体重和血钙浓度来检测本发明嵌合抗体和人源化抗体对人肺癌LC-6诱导的高钙血症的治疗效能。
用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)体内移植人肺癌株系LC-6。购买了5周大的雄性BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)用于评价药理效能，然后使它们适应一周，因此该实验使用了六周大的鼠。
制备高钙血症模型鼠并将它们按照下列方式分组。切下移植的人肺癌LC-6，并精切成3mm的立方体。得到的肿瘤块皮下移植到鼠皮瓣下，每只鼠移植一块。移植后两或三周，当确定每只鼠的肿瘤体积都足够大时，将鼠按照肿瘤体积、血钙浓度、和体重平均分组，这样处理的鼠被用做高钙血症模型动物。
对高钙血症治疗效能进行如下检测。单剂量的具有“q”型L链抗PTHrP的嵌合抗体或人源化抗体给上述每只高钙血症模型鼠的尾静脉分别以10或30μg/鼠剂量给药。给药后第1天、第3天、第6天和第10天分别测量每只鼠的血钙浓度和体重以评价抗体的治疗效能。血钙浓度用血细胞比容管从每只鼠眼眶取血，并用643自动Ca2+/pH分析仪(CIBA-CORNING)测定全血钙离子浓度作为血钙浓度。
结果发现具有“q”型L链的嵌合抗体和人源化抗体对携带人肺癌LC-6的高钙血症模型动物给药导致受体体重和血钙浓度的迅速改善以及延长期保留的增加。该结果表明本发明的嵌合抗体和人源化抗体是治疗高钙血症相关恶性肿瘤的有效药物(见图18)。
实施例8利用BIACORE分析PTHrP和抗-PTHrP抗体之间相互作用的动力学该实验中，利用BIACORE分析抗原-抗体相互作用的动力学。PTHrP(1-34+Cys)用做抗原，其C-末端特异地吸附到传感器顶端。各种浓度的纯化抗体用做被分析物。从获得的传感图计算动力学指标(结合率常数“kass”和解离率常数“kdiss”)。动力学分析中参考了文献“基于新型生物传感器的分析体系的单克隆抗体-抗原相互作用的动力学分析”，Karlsson，R.等，(1991)，免疫学方法杂志，145，p.229-240。
(1)PTHrP(1-34+C)固定到传感器顶端PTHrP(1-34+C)吸附到传感器顶端CM5(Pharmacia)。
使用HBS(10mM HEPES，pH 7.4；0.15M NaCl；3.4mM EDTA；0.005％表面活性剂P20)作为流动缓冲液，流速5μl/分钟。注射100μl0.05M N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/0.2M N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和100μl 80mM 2-(2-吡啶二硫)乙酰胺(PDEA)/0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)，激活传感器顶端CM5上羧甲基葡聚糖的羰基，另外注射10μl 5μg/毫升的PTHrP(1-34+C)/10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)，使得所述羰基特异吸附到PTHrP(1-34+C)C-末端的半胱氨酸残基上。随后，注射100μl 50mM(L)-半胱胺酸/1M NaCl/0.1M甲酸钠缓冲液(pH 4.3)以封闭过量的活化基团。随后，注射10μl 0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.5)和10μl 10mM HCl以冲洗具有非共价结合的基质。固定的PTHrP(1-34+C)的量为226.4RU(共振单位)(图19)。
(2)免疫接种的PTHrP(1-34+C)和纯化的鼠抗PTHrP抗体之间的相互作用使用HBS作为流动缓冲液，流速为20μl/分钟。将抗体生成杂交瘤注射到Balb/c鼠的腹腔，两周后收集腹水，加样到用于纯化抗体的蛋白A柱。纯化的#23-57-137-1抗体指定为“MBC”，纯化的3F5抗体指定为“3F5”。这些抗体用HBS稀释到1.25，2.5，5，10和20μg/毫升一系列浓度。
分析中，注射40μl抗体溶液两分钟以得到结合相，然后注射HBS两分钟以得到解离相。完全解离后，注射10μl 10mM HCl恢复传感器顶端。结合-解离-恢复作为一个循环，注射各种抗体溶液获得传感图进行分析。
(3)固定化PTHrP(1-34+C)和纯化的人源化抗PTHrP抗体之间的相互作用使用HBS作为流动缓冲液，流速为20μl/分钟。抗体由CHO细胞制备，用蛋白A柱纯化。纯化的嵌合抗体指定为“chMBC”，纯化的m和q型人源化抗体分别指定为“hMBCm”和“hMBCq”，这些抗体用HBS稀释到1.25，2.5，5，10和20μg/毫升一系列浓度。
分析中，注射40μl抗体溶液两分钟以得到结合相，然后注射HBS两分钟以得到解离相。完全解离后，注射10μl 10mM HCl恢复传感器顶端。结合-解离-恢复作为一个循环，注射各种抗体溶液获得传感图进行分析。
(4)相互作用的动力学分析记录感兴趣的数据，通过覆盖感兴趣的反应区比较反应模式(图20-24)。在附图20-24各图中，从上到下的连续线表示抗体浓度为1.25，2.5，5，10和20μg/毫升的数据。另外，通过特别为BIACORE设计的分析软件“BIAevaluation 2.1”(Pharmacia)进行相互作用的动力学分析，其能够通过曲线切割计算动力学指标(结合率常数“kass”和解离率常数“kdiss”)(表4和5)。
表4MBC和3F5的动力学指标

表5嵌合抗体和人源化抗体的动力学指标

该实验中，为确定结合率常数，使用了分析模型4(BIAevaluation2.1软件手册，A1-A5)。
实施例9恶性肿瘤相关高钙血症模型中磷分泌的抑制恶性肿瘤相关高钙血症(HHM)是PTHrP出现而导致的疾病，已知PTHrP加速骨重吸收和肾脏及输尿管对钙的重吸收，导致形成高钙血症。另一方面，就磷而言，PTHrP抑制肾脏和输尿管对磷的重吸收，导致形成排泄作用，因此临床HHM病人经常形成低磷血症。其中，利用恶性肿瘤相关高钙血症模型鼠检测了人源化抗-PTHrP抗体对肾脏磷排泄的影响。
移植人肺癌LC-6的裸大鼠(实验动物中心购买)用做模型动物。已知皮下移植人肺癌LC-6的裸大鼠倾向于血钙浓度增加及肿瘤体积的增大，结果，大鼠形成与，例如体重和自发活性降低，有关的高钙血症。利用这种动物模型，基于下述磷酸盐部分排泄的肾清除率法检测了本发明的人源化抗PTHrP抗体对肾脏磷排泄的影响。
利用BALB/c-nu/nu裸大鼠(Nippon Kurea)进行体内人肺癌LC-6的移植。购买五周大的雄性F344N/Jcl-rnu裸大鼠(Nippon Kurea)，使它们适应一周，这些六周大的大鼠用于评价药理效能。
恶性肿瘤相关高钙血症模型动物如下制备。切下移植的人肺癌LC-6，精切成3mm的立方块。得到的肿瘤块皮下移植到鼠皮瓣下，每鼠一块。移植后约三十天，确定每只鼠的肿瘤体积已经足够大(3000mm3)，基于血钙浓度和体重选择可以用作恶性肿瘤相关高钙血症模型动物的大鼠。
肾清除率法检查磷排泄如下进行。
(1)肾清除法用戊巴比妥(Nembutal，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd)麻醉恶性肿瘤相关高钙血症模型动物，仰卧固定在37℃的保温垫上，膀胱插入套管以收集尿(聚乙烯管，PE50，Nippon Beckton Dickinson)。随后，在模型动物的股静脉插入灌注管(聚乙烯管，PE50，Nippon BecktonDickinson)，然后用灌注泵(Terufusion注射泵STC-525；TERUMO)通过灌注管向模型动物导入灌注液(0.7％菊粉，5％甘露醇，0.2％戊巴比妥，0.9％氯化钠)，流速为2毫升/小时。平衡50分钟后，通过套管20分钟收集尿液5次(即，1期-5期)，得到尿样。每次收集尿的中间时间点，用肝素处理的注射器从模型动物的右颈静脉收集约0.25毫升的血样。
(2)抗体的给药上述清除率检测中，在收集尿液2期刚开始的时间点，对动物静脉注射人源化抗-PTHrP抗体，剂量为1毫克/毫升/千克。
(3)尿和血中菊粉和磷浓度的确定测量1期和5期获得的尿样的体积，然后测定它们的菊粉和磷浓度。上述获得的血样低温离心，获得血浆样品，用于测定菊粉和磷浓度。通过硫酸-蒽酮法(Roe，L等，生物化学杂志178，839-845，1949)测定菊粉的浓度，用无机磷测定试剂——Autosera IP(Daiichi PureChemicals)通过7170型Hitachi自动分析仪按照手册(Physke-Sabaroh法)测定磷浓度。
(4)菊粉清除率、磷清除率和磷部分排泄的计算按照下列公式计算菊粉清除率(Cin)，磷清除率(Cp)和磷相对排泄率(FEp)。
菊粉清除率(Cin)的计算Cin＝Uin V/Pin其中Cin代表菊粉清除率(毫升/千克/分钟)；Uin代表尿中菊粉的浓度(毫克/毫升)；V代表单位时间尿量(毫升/千克/分钟)；Pin代表血中菊粉的浓度(毫克/毫升)。
磷清除率(Cp)的计算Cp＝Up V/Pp其中Cp代表磷清除率(毫升/千克/分钟)；Up代表尿中磷的浓度(毫克/毫升)；V代表单位时间尿量(毫升/千克/分钟)；Pp代表血中磷浓度(毫克/毫升)。
磷相对排泄率(FEp)的计算FEp＝Cp/Cin其中FEp代表磷相对排泄率；Cin代表菊粉的清除率；Cp代表磷清除率。用四只动物进行检测。结果表示为平均值±标准差。
磷组分排泄率和血液中磷浓度的结果显示于图25和26。
图25说明磷相对组分排泄率(＝磷清除率/菊粉清除率)随清除时间(1期＝20分钟)的变化关系。人源化抗-PTHrP抗体(1毫克/千克)在2期的开始给药(静注)。
图26说明血浆磷浓度随清除时间(1期＝20分钟)的变化关系。人源化抗-PTHrP抗体(1毫克/千克)在2期的开始给药(静注)。
结果发现，使用抗体给药后(即，2期和5期)得到的磷组分排泄率与使用抗体前(即，1期)得到的磷相对排泄率相比明显被抑制。换句话说，发现对形成低磷血症(导致磷加速排泄，FEp＞0.2)的个体使用中和抗体给药，使受体磷的重吸收大致恢复到正常水平(磷重吸收分数＝1-FEp＞0.8％)，结果观察到个体血磷浓度趋向正常。该结果表明本发明抗体可以作为治疗磷加速排泄和PTHrP导致的低磷血症的有效治疗药物。
因为PTHrP是导致恶性肿瘤相关高钙血症的物质，预示PTHrP可能促进磷排泄和降低组织中的高能有机磷。因此，各种与低磷血症相关的疾病，例如低磷性佝偻病和低磷性抗维生素D佝偻病，认为主要由磷经由尿排泄的增加导致，因此本发明的抗体也会对治疗这类疾病有效。
实施例10各种恶性肿瘤相关高钙血症的临床症状的改善已知恶性肿瘤相关高钙血症是由于肿瘤产生了PTHrP，并且PTHrP加速骨重吸收以及肾脏和输尿管对钙的重吸收(导致高钙血症)而导致。另外，观察到高钙血症病人临床症状恶化，例如不良性能状态，意识低下，系统系不适，饮水习性，恶心和呕吐(厌食)。用人肿瘤裸家鼠移植系统和人肿瘤裸鼠移植系统的高钙血症模型动物检测了抗-PTHrP抗体对这些临床症状的影响。
人肺癌LC-6移植的裸家鼠和裸大鼠(购自实验动物中心)作为高该血症模型动物。移植人肺癌LC-6的裸家鼠和裸大鼠倾向于表现血钙浓度的增加和肿瘤体积的增加，其导致高钙血症相关的体温和体重降低。
用人肺癌LC-6裸家鼠移植系统检测了鼠抗-PTHrP抗体对恶性肿瘤相关高钙血症一般临床症状的改善作用，结果用照片显示。用人肺癌LC-6裸家鼠移植系统检测了抗体对自发活性和体温的降低以及厌食的改善作用。
1.高钙血症的表观临床症状的改善利用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Kurea)体内移植人肺癌株系LC-6。购买五周大的雄性BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Kurea)，使它们适应一周，这些六周大的鼠用于评价药理效能。
制备高钙血症模型鼠，并将它们按下列方式分组。切下移植的人肺癌LC-6，精切成3mm的立方块。得到的肿瘤块皮下方式移植到鼠皮瓣下，每鼠一块。移植后约二十七天，确定每只鼠的肿瘤体积已经足够大时，按照鼠的肿瘤体积、血钙浓度和体重将鼠平均分组，然后鼠用做高钙血症模型动物。
通过测量肿瘤的最大直径(a mm)和最小直径(b mm)并且用这两个测量值按照Galant’s计算式[ab2/2]计算确定肿瘤体积。
用血细胞比容管从每只鼠眼眶取血，并用643自动Ca2+/pH分析仪(CIBA-CORNING)测定全血钙离子浓度作为血钙浓度。
抗体对高钙血症治疗效能的检测按照下列方式进行。给上述每只高钙血症模型动物在移植肿瘤后第27，30，34，37天经尾静脉注射鼠抗PTHrP抗体，剂量为每只鼠100μg。磷酸盐缓冲的生理盐水代替该抗体按照同样方式给药，用于制备对照。移植肿瘤后第41天，从使用抗体给药组和对照组分别选择一只典型的鼠，连同一只正常鼠拍照。
结果是，对于一只移植了人肺癌LC-6的高钙血症模型动物，虽然使用抗体给药鼠(如图27和28的中图所示)与对照鼠(如图27和28的右图所示)相比具有同样水平的肿瘤块，但它们表现与正常鼠(如图27和28的作图所示)同样水平的表观。该结果表明抗PTHrP抗体的给药改善了表观临床症状(图27和28)。
2.高钙血症相关自发活性降低的改善利用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Kurea)体内移植人肺癌LC-6。购买五周大的雄性F344/NJcl-run裸大鼠(Nippon Kurea)，使它们适应一周，这些六周大的大鼠用于评价药理效能。
按照下列方式制备高钙血症模型动物。切下移植的人肺癌LC-6，精切成3mm的立方块。得到的肿瘤块皮下方式移植到鼠皮瓣下，每鼠一块。移植后约三十天，确定每只鼠的肿瘤体积已经足够大时，按照鼠的肿瘤体积、血钙浓度和体重将鼠平均分组，然后鼠用做高钙血症模型动物。
用血细胞比容管从每只鼠眼眶取血，并用643自动Ca2+/pH分析仪(CIBA-CORNING)测定全血钙离子浓度作为血钙浓度。
(1)确定自发活性的方法用SE型ANIMEX活性计量器(FARAD，Electronics，Sweden)确定自发活性，该装置放置在各单独饲养(水和食物)的模型动物的聚乙烯笼中的预测定位置。该装置设计为测量每只大鼠的运动量。通过这种装置，运动量记录为一定时间段的次数。该测量进行13小时(从某一天晚7点到第二天早8点)，结果记作次/小时。
(2)抗体的给药对上述制备的形成高钙血症的每只大鼠经尾静脉注射人源化抗-PTHrP抗体(剂量为5毫克/0.5毫升/千克)作为对照。对另一组大鼠以同样方式注射盐水。给药的抗体鼠和对照鼠轮流进行测量。
第0(即，给药抗体的前一天)，2，4，7和14天对给药的抗体鼠进行测量，第1，3，5，8和15天对对照鼠进行测量。
结果，检测期间对照大鼠没有表现自发活性的变化或降低，而使用抗体鼠给药第4天后表现自发活性的增加(图29)。
3.高钙血症相关体温降低的改善人肺癌LC-6的移植和恶性肿瘤相关高钙血症模型动物的制备如上述步骤2同样的方式进行。
(1)体温测量方法用戊巴比妥(Nembutal，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)麻醉动物，直肠插入温度传感器，通过数字温度仪测量体温。
(2)抗体的给药对上述每只高钙血症模型大鼠经尾静脉注射人源化抗-PTHrP抗体，剂量为1毫克/毫升/千克。对另一些模型大鼠经尾静脉注射生理盐水作为对照。另外，也测量了没有使用抗体给药的正常大鼠的体温。分别对所有使用抗体大鼠、对照鼠和正常鼠在给药的第0天(即，给药当天)，1，2天和3天之后测量体温。
结果是，测量期间正常鼠没有表现体温变化(34.2-34.4℃)，而恶性肿瘤相关高钙血症模型大鼠比正常大鼠体温降低约2℃。当对模型大鼠使用人源化抗-PTHrP抗体给药后，恶性肿瘤相关高钙血症模型大鼠降低的体温明显恢复到给药后三天的正常鼠体温的同样水平。这些结果表明本发明的人源化抗PTHrP抗体对恶性肿瘤相关高钙血症模型动物体温降低有明显的改善作用(图30)。
4.对诱导的食物摄取减少的改善人肺癌LC-6的移植和高钙血症模型动物的制备如上述第2节描述的同样方式进行。制备的模型动物按照血钙浓度和体重平均分组，这样的鼠用于下述实验。
(1)食物摄取的量的测量检测期间，大鼠单独放置于新陈代谢笼，饲喂水和食物。对每只大鼠，摄取量确定为24小时的食物量(g)(从某一天早9时到第二天早9时)。测量第一天早9时和第二天早9时的饲料罐总重，计算二者的重量差以确定食物摄取量。
(2)抗体的给药对上述每只高钙血症模型大鼠(HHM鼠)经尾静脉注射人源化抗-PTHrP抗体，剂量为5毫克/0.5毫升/千克。对对照组每只动物以同样方式经尾静脉注射生理盐水。对每只正常大鼠也以同样方式经尾静脉注射生理盐水。在第0天(即，给药前一天到给药当天的时间段)，第1天(即，给药当天到第二天的时间段)，第3天(即，给药后第三天到第四天的时间段)和第5天(即，给药后第5天到第6天的时间段)对所有使用抗体鼠、对照鼠和正常大鼠测量食物摄取量。
结果是，使用抗体给药前，高钙血症模型大鼠(5-9只大鼠)的摄取量平均为8.11g，而正常大鼠平均为12.06g，这表明高钙血症模型大鼠摄取量明显减少。当对模型大鼠使用人源化抗PTHrP抗体后，给药抗体后当天及其后，虽然对照大鼠的摄取量没有观察到变化，但是给药抗体鼠的摄取量恢复到正常鼠的水平。这些结果表明本发明的人源化抗PTHrP抗体对恶性肿瘤相关高钙血症模型动物摄取量降低有明显改善作用(表6)。
表6对摄食的影响

*使用盐水给药0.5毫升/千克，经尾静脉；使用抗体给药5毫克/0.5毫升/千克，经尾静脉。
上述结果论证了本发明的嵌合抗体和人源化抗体可以作为改善恶性肿瘤相关高钙血症的各种临床症状的有效药物。
5.高钙血症导致的血液pH值降低的改善人肺癌LC-6的移植和恶性肿瘤相关高钙血症模型动物的制备如上述第2步同样的方式进行。模型动物按照血钙浓度和体重平均分组。
(1)血液pH的测定通过心脏采血技术用肝素处理的注射器对每只待检动物采血，然后将取到的血样应用于643Ca2+/pH自动分析仪(CIBA-CORNING)以测定血样的pH值。
(2)抗体的给药对上述每只高钙血症模型大鼠(HHM大鼠)经尾静脉注射人源化抗-PTHrP抗体，剂量为5毫克/0.5毫升/千克(n＝3)。对对照组每只动物(n＝2)以同样方式经尾静脉注射生理盐水。在第0天(即，给药当天)，第1天和第7天对所有使用抗体大鼠和对照鼠测量血液pH值。
结果是，使用抗体给药前，高钙血症模型大鼠得到的血液pH值约为7.49(而正常大鼠为7.40±0.02)，这意味着模型大鼠明显形成代谢性碱中毒。当对模型大鼠使用本发明的人源化抗PTHrP抗体后，虽然对照大鼠的血液pH值几乎无变化，但是使用抗体给药鼠的血液pH值恢复到接近使用抗体后七天正常鼠的血液pH值。代谢性碱中毒作为恶性肿瘤相关高钙血症(HHM)的临床症状之一已有报道，由于肾脏碳酸氢根离子(HCO3-)排泄的抑制导致该症状。因为使用本发明的人源化抗-PTHrP抗体可以使高钙血症模型动物的血液pH值达到正常，表明该抗体可以改善HHM中发现的代谢性碱中毒(图31)。
上述结果论证了本发明的嵌合抗体和人源化抗体可以作为改善恶性肿瘤相关高钙血症的临床症状的有效药物。
工业实用性本发明提供了抗PTHrP嵌合抗体和人源化抗体。这些抗体对人具有低抗原性，因此可以作为治疗高钙血症、低磷血症等的有效药物。
序列表(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO1AAATAGCCCT TGACCAGGCA 20(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”
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(xi)序列描述SEQ ID NO4GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA 29(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO5GTTTTCCCAG TCACGAC17(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”
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(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G 41(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度109个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO11GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度110个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO12GGTTTGGTGGTCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度98个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO13GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG98(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度106个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO14TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC106(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO15GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC43(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
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(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO18GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA 39(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO19GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC 46(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO20TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34(2)SEQ ID NO21的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO21GTCTAAGCTT CCACCATGGCCTGGACTCCT CTCTT35(2)SEQ ID NO22的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO22TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC 48(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征(A)长度128个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO23贴SEQ ID NO23(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征(A)长度125个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO24贴SEQ ID NO24(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度132个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO25贴SEQ ID NO25(2)SEQ ID NO26的资料
(i)序列特征(A)长度110个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO26贴SEQ ID NO26(2)SEQ ID NO27的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO27GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG 30
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(xi)序列描述SEQ ID NO31贴SEQ ID NO31(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征(A)长度114个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO32贴SEQ ID NO32(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO33ACAAAGCTTC CACCATG 17(2)SEQ ID NO34的资料(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO34CTTGGATCCG GGCTGACCT 19(2)SEQ ID NO35的资料(i)序列特征(A)长度75个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
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(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO37ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA 46(2)SEQ ID NO38的资料(i)序列特征(A)长度111个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO38贴SEQ ID NO38(2)SEQ ID NO39的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO39CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT 42(2)SEQ ID NO40的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO40CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG26(2)SEQ ID NO41的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO41GAGAAGGGCCCTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA35(2)SEQ ID NO42的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO42CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG35(2)SEQ ID NO43的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO43GGCTTGGAGC TCCTCAGA18(2)SEQ ID NO44的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO44GACAGTGGTT CAAAGTTTTT20(2)SEQ ID NO45的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO45Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg65 70 75Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO46的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质
(xi)序列描述SEQ ID NO46Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp80 85 90Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe95 100 105Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala110 115(2)SEQ ID NO47的资料(i)序列特征(A)长度116个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO47
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly110 115(2)SEQ ID NO48的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO48
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO49的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO49Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO50的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO50Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO51的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO51Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO52的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO52Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO53的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO53Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO54的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO54Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO55的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO55Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO56的资料(i)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO56Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly1 5 10 15Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe95 100 105Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115(2)SEQ ID NO57的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO57ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys-15 -10 -5GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu1 5 10GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
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(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO58ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg-15 -10 -5GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val1 5 10GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly15 20 25TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro30 35 40GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser45 50 55TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser60 65 70AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu75 80 85AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr
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(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO60Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr15(2)SEQ ID NO61的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO61Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr15(2)SEQ ID NO62的资料(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO62Pro Tyr Trp Met Gln1 5(2)SEQ ID NO63的资料(i)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO63Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO64的资料(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO64Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO65的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO65ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser1 5 10TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25
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(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO66ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115(2)SEQ ID NO67的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO67ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO68的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO68ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO69的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO69ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO70的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO70ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO71的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO71ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC GAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO72的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO72ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys LeuThr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO73的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO73ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO74的资料(i)序列特征(A)长度411个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO74ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO75的资料(i)序列特征(A)长度34个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO75Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu20 25 30Ile His Thr Ala
权利要求
1.包含人抗体L链C区和小鼠抗人副甲状腺激素相关蛋白单克隆抗体L链V区的嵌合L链。
2.按照权利要求1的嵌合L链，其中L链V区包括如SEQ IDNO45所示的氨基酸序列。
3.按照权利要求1的嵌合L链，其中C区是Cλ链。
4.包含人抗体H链C区和小鼠抗人副甲状腺激素相关蛋白单克隆抗体H链V区的嵌合H链。
5.按照权利要求4的嵌合H链，其中H链V区包括如SEQ IDNO46所示的氨基酸序列。
6.按照权利要求4的嵌合H链，其中C区是Cγ1链。
7.抗人副甲状腺激素相关蛋白的嵌合单克隆抗体，包含权利要求1-3之一的嵌合L链和权利要求4-6之一的嵌合H链。
8.抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体，其解离常数为1.86×10-7[M]或更低。
9.抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体，其解离率常数为1.22×10-1[l/Sec]或更低。
10.抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体，其结合率常数为6.55×104[l/M.Sec]或更高。
11.抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体，其解离率常数为1.22×10-1[l/Sec]或更低，而结合率常数为6.55×104[l/M.Sec]或更高。
12.按照权利要求8的抗体，其中解离常数通过表面胞质团共振传感器测定。
13.按照权利要求9或11的抗体，其中解离率常数通过表面胞质团共振传感器测定。
14.按照权利要求10或11的抗体，其中结合率常数通过表面胞质团共振传感器测定。
15.按照权利要求8的抗体，其中解离常数为1.02×10-11-1.86×10-7[M]。
16.按照权利要求8的抗体，其中解离常数为1.02×10-10-1.86×10-8[M]。
17.按照权利要求8的抗体，其中解离常数为1.34×10-10-3.58×10-10[M]。
18.按照权利要求9的抗体，其中解离率常数为7.38×10-6-1.22×10-1[l/Sec]。
19.按照权利要求9的抗体，其中解离率常数为7.38×10-5-1.22×10-2[l/Sec]。
20.按照权利要求9的抗体，其中解离率常数为1.66×10-4-3.16×10-4[l/Sec]。
21.按照权利要求9的抗体，其中解离率常数为2.32×10-4[l/Sec]。
22.按照权利要求10的抗体，其中结合率常数为6.55×104-1.24×107[l/M.Sec]。
23.按照权利要求10的抗体，其中结合率常数为6.55×105-1.24×106[l/M.Sec]。
24.按照权利要求10的抗体，其中结合率常数为7.23×105-1.03×106[l/M.Sec]。
25.按照权利要求10的抗体，其中结合率常数为1.03×106[l/M.Sec]。
26.抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体，其解离率常数为2.32×10-4-3.16×10-4[l/Sec]，而结合率常数为0.883×106-1.03×106[l/M.Sec]。
27.按照权利要求8-26之一的抗体，其中抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或灵长类化抗体。
28.包括编码小鼠抗人副甲状腺激素相关蛋白单克隆抗体L链V区的碱基序列的DNA。
29.按照权利要求28的DNA，其中L链V区包括如SEQ ID NO45所示的氨基酸序列。
30.按照权利要求28的DNA，其中编码L链V区的碱基序列如SEQ ID NO65所示。
31.包含编码小鼠抗人副甲状腺激素相关蛋白单克隆抗体H链V区的碱基序列的DNA。
32.按照权利要求31的DNA，其中H链V区包括如SEQ ID NO46所示的氨基酸序列。
33.按照权利要求31的DNA，其中编码H链V区的碱基序列如SEQ ID NO57所示。
34.编码权利要求1-3之一的嵌合L链的DNA。
35.按照权利要求34的DNA，其中编码嵌合L链的DNA包括如SEQ ID NO65所示的碱基序列。
36.编码权利要求4-6之一的嵌合H链的DNA。
37.按照权利要求36的DNA，其中编码嵌合H链的DNA包括如SEQ ID NO57所示的碱基序列。
38.包含权利要求28-37之一DNA的重组载体。
39.用权利要求38的重组载体转化的转化体。
40.制备抗人副甲状腺激素相关蛋白嵌合抗体的方法，包括培养转化体，所述转化体用含有权利要求28-30，34和35之一的DNA的表达载体和含有权利要求31-33，36和37之一的DNA的表达载体转化，并且从得到的培养物中收集抗人副甲状腺激素相关蛋白的嵌合抗体。
41.包括权利要求8-27之一的抗体作为有效成分的药物组合物。
42.一种药剂，用于抑制高钙血症，其包括权利要求8-27之一的抗体作为有效成分。
43.一种药剂，用于抑制与恶性肿瘤相关的高钙血症，其包括权利要求8-27之一的抗体作为有效成分。
44.按照权利要求43的用于抑制高钙血症的药剂，其中恶性肿瘤至少一种选自下述癌症胰腺癌、肺癌、咽癌、喉癌、舌癌、齿龈癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌和前列腺癌，以及恶性淋巴瘤。
45.一种药剂，用于改善低磷血症，其包括权利要求8-27之一的抗体作为有效成分。
46.按照权利要求45的用于改善低磷血症的药剂，其中低磷血症是低磷性佝偻病。
47.按照权利要求45的用于改善低磷血症的药剂，其中低磷血症是低磷性维生素-D抗性佝偻病。
48.一种药剂，用于预防或治疗与恶性肿瘤相关的体重减轻，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
49.按照权利要求48的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
50.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的食物摄取降低，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
51.按照权利要求50的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
52.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的厌食或恶心，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
53.按照权利要求52的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
54.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的代谢性碱中毒，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
55.按照权利要求54的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
56.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的血液pH异常，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
57.按照权利要求56的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
58.一种药剂，用于控制与恶性肿瘤相关的体温的变化，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
59.按照权利要求58的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
60.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的体温的降低，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
61.按照权利要求60的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
62.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的自发性活动降低，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
63.按照权利要求62的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
64.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的性能状况，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
65.按照权利要求64的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
66.一种药剂，用于预防或改善与恶性肿瘤相关的病人的QOL降低，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
67.按照权利要求66的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
68.一种载体的制备方法，所述载体含有编码人L链κ链C区的DNA和编码人L链λ链V区的DNA，其中所述方法包括紧邻编码人L链κ链C区的DNA提供限制性位点，然后将编码人L链λ链V区的DNA与限制性位点连接。
69.一系列抗体V区框架区的制备方法，其中所述方法包括设计一系列突变引物，所述引物编码具有所需突变的框架区的氨基酸序列，以及利用一种质粒作为模板和一系列突变引物的混合物进行PCR。
70.按照权利要求8-26之一的抗体，其中L链为λ链。
71.一种药剂，用于预防或改善低磷血症，其包括能够抑制副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)及其受体之间的结合的物质作为活性成分。
72.按照权利要求71的药剂，其中所述物质为抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体。
全文摘要
本发明公开了一种抗人副甲状腺激素相关肽的抗体，编码该抗体的DNA，包含该DNA的重组载体，该载体转化的转化体，制备该抗体的方法，以及该抗体的应用。
文档编号A61P35/00GK1817906SQ200410044738
公开日2006年8月16日 申请日期1997年9月24日 优先权日1996年9月26日
发明者佐藤功, 若原裕二, 薮田尚弘 申请人:中外制药株式会社