猪rbp4蛋白体外表达及其抗体制备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及猪RBP4蛋白的体外表达及其抗体的制备。
【背景技术】
[0002] 视黄醇结合蛋白（Retinol-Binding Proteins，RBPs)是体内一种低分子量的载脂 蛋白，有四种结构形式，分别为RBP-l、RBP-2、RBP-3和RBP4。其中RBP4是一种主要在肝脏 表达的转运蛋白，主要作用是结合和转运VitaminA(VA)。随着对其功能的深入研宄，发现 许多肝脏外组织也能合成RBP4,如大鼠的卵黄囊，猪、绵羊和奶牛的孕体、子宫、胎盘组织， 并且Harney等研宄表明，子宫中RBP4的表达水平可能受激素的调节。目前研宄表明，RBP4 在家畜生产性能，尤其在猪繁殖性能方面具有重要意义，已经成为母猪高产仔数的理想候 选基因。研宄报道，RBP4基因存在两种基因型，基因型之间的差异为0.5头/窝（总产仔 数）和0.26头/窝（产活仔数）。我国学者在一些地方猪种中也发现了显著影响猪总产仔 数和产活仔数的RBP4基因型。RBP4基因除了与繁殖性状相关以外，也能直接影响动物的胚 胎发育。用siRNA干扰技术抑制小鼠RBP4合成后，导致胚胎卵黄血管、脑神经血管和眼部 畸形，然而，添加外源RBP4后胚胎发育恢复正常，说明，RBP4在胚胎发育过程中具有重要的 调节作用。因此，猪RBP4蛋白体外表达及制备特异性结合猪RBP4蛋白的抗体具有重要的 意义。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供猪RBP4蛋白体外表达及其抗体制备。
[0004] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 一种猪RBP4蛋白体外表达的方法，获得猪RBP4目的基因，将猪RBP4目的基因与 表达载体重组后转化表达宿主菌，诱导猪RBP4蛋白的表达。
[0006] 在一些实施方案中，所述猪RBP4目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 在一些实施方案中，所述表达载体为pEASY-El。
[0008] 在一些实施方案中，所述表达宿主菌为BL21 (DE3) pLySs。
[0009] 在一些实施方案中，所述诱导为宿主菌培养后加入IPTG至终浓度为lmmol/L。
[0010] 本发明还提供了一种制备猪RBP4蛋白的抗体的方法，以猪RBP4蛋白为抗原免疫 家兔获得猪RBP4蛋白多克隆抗体血清。
[0011] 在一些实施方案中，所述猪体RBP4蛋白为猪RBP4目的基因体外表达后经纯化、复 性得到。
[0012] 在一些实施方案中，所述体外表达为原核表达。
[0013] 在一些实施方案中，所述纯化为镍柱亲和层析纯化。
[0014] 在一些实施方案中，所述复性为尿素溶液透析复性。
[0015] 本发明还提供了所述制备方法制备的猪RBP4蛋白抗体。
[0016] 本发明通过Western Blot实验验证所述抗体的特异性，结果显示本发明所述猪 RBP4蛋白抗体特异性好，能够特异性猪肝脏组织蛋白和纯化的猪RBP4蛋白。
[0017] 本发明还提供了上述猪RBP4蛋白抗体在制备用于检测猪RBP4蛋白的免疫检测工 具中的应用。
[0018] 具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
[0019] 在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述猪RBP4蛋 白抗体，可检测组织细胞中RBP4的表达状况。
[0020] 与现有技术相比，本发明提供了一种猪RBP4蛋白体外表达的方法以及以表达的 蛋白制备猪RBP4蛋白抗体的方法。本发明所述猪RBP4蛋白抗体可与猪肝脏组织蛋白和纯 化的猪RBP4蛋白特异性结合，特异性好，广泛适用于各种检测猪RBP4蛋白的免疫检测工 具。
【附图说明】
[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0022] 图1示实施例1RBP4基因PCR电泳结果，其中泳道M为2000bp marker，泳道1为 RBP4基因PCR电泳结果；
[0023] 图2示实施例110% SDS-PAGE电泳分析结果图，其中泳道M为蛋白marker、泳道 1为BL21 (DE3)pLysS空菌体、泳道2为常规LB培养的含表达载体的BL21 (DE3)pLysS菌体 未诱导组、泳道3为添加1%葡萄糖LB培养的含表达载体的BL21 (DE3)pLysS未诱导组、泳 道 4-5 为含 pEASY-El-RBP4 的 BL21 (DE3)pLysS 诱导后上清、泳道 6-7 为含 pEASY-El-RBP4 的BL21 (DE3)pLysS诱导后沉淀；
[0024] 图3示实施例2Western Blot分析结果，其中泳道1为实施例1获得的包涵体蛋 白、泳道2为不含表达载体的空菌破碎沉淀、泳道3为含表达载体未诱导组破碎沉淀；
[0025] 图4示实施例3纯化蛋白的10% SDS-PAGE电泳分析结果图，其中泳道M为蛋白 marker，泳道1和2为纯化蛋白；
[0026] 图5示实施例4复性蛋白的10% SDS-PAGE电泳分析结果图，其中泳道M为广谱彩 虹预染marker，泳道1为复性蛋白；
[0027] 图6示实施例4复性蛋白的Western Blot分析结果，其中泳道1为透析复性蛋白 1，泳道2为透析复性蛋白2;
[0028] 图7示实施例6以实施例4透析复性后的RBP4蛋白进行猪卵泡颗粒细胞体外添 加实验的MTT检测结果图，其中横坐标为添加的透析复性后的RBP4蛋白的浓度；纵坐标为 细胞活力；
[0029] 图8示实施例8以实施例3纯化的RBP4蛋白为抗原，以实施例7制备的抗体为一 抗Western Blot检测的结果图，其中泳道1为纯化蛋白，泳道2为空白对照；
[0030] 图9示实施例8以猪肝脏组织蛋白为抗原，以实施例7制备的抗体为一抗Western Blot检测的结果图，其中泳道1为猪肝脏组织蛋白1，泳道2为猪肝脏组织蛋白2。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0032]实施例1、猪RBP4蛋白体外表达
[0033] l、Trizol法提取正常成年母猪卵巢组织总RNA，并进行反转录。
[0034]2、猪RBP4基因CDS序列扩增：
[0035]猪 RBP4 基因606bp，序列如 SEQID NO.1 所示。
[0036]扩增引物：F: 5，-ATGGAATGGGITTGGGC-3'，
[0037] R: 5' -CTACAAAATGTTTCTTTCCGAT-3'
[0038] PCR过程：
[0039]
【主权项】
1. 一种猪RBP4蛋白体外表达的方法，获得猪RBP4目的基因，将猪RBP4目的基因与表 达载体重组后转化表达宿主菌，诱导猪RBP4蛋白的表达。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述猪RBP4目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不〇
3. 根据权利要求1或2所述的方法，所述表达载体为pEASY-El。
4. 根据权利要求1-3任意一项所述的方法，所述表达宿主菌为BL21 (DE3)pLySs。
5. 根据权利要求1-3任意一项所述的方法，所述诱导为宿主菌培养后加入IPTG至终浓 度为 lmmol/L。
6. -种制备猪RBP4蛋白的抗体的方法，以猪RBP4蛋白为抗原免疫家兔获得猪RBP4蛋 白多克隆抗体血清。
7. 根据权利要求6所述的方法，所述猪体RBP4蛋白为猪RBP4目的基因体外表达后经 纯化、复性得到。
8. 根据权利要求7所述的方法，所述体外表达为原核表达。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，所述纯化为镍柱亲和层析纯化。
10. 根据权利要求6-9任意一项所述的方法，所述复性为尿素溶液透析复性。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，提供了一种猪RBP4蛋白体外表达的方法以及以表达的蛋白制备猪RBP4蛋白抗体的方法。本发明所述猪RBP4蛋白抗体可与猪肝脏组织蛋白和纯化的猪RBP4蛋白特异性结合，特异性好，广泛适用于各种检测猪RBP4蛋白的免疫检测工具。
【IPC分类】C12N15-70, C12N15-12, C07K16-18
【公开号】CN104673818
【申请号】CN201510133999
【发明人】孙丽娜, 周虚, 陈璐, 李纯锦, 赵云, 陈树雄, 刘卓, 李万宏, 李洪蛟, 于佳鑫, 王昊天, 刘亚亭, 王凤鸽, 高珊, 蒋彦文
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月25日