专利名称：锌指蛋白hzf1抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物蛋白的特异性抗体、其制备方法及其应用。更具体地，本发明涉及锌指蛋白HZF1的特异性多克隆和单克隆抗体、它们的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。该抗体可应用于与HZF1功能和红系细胞分化和巨核细胞分化异常相关的肿瘤、贫血和细胞减少症的诊断以及与HZF1表达和功能和其他细胞和组织分化发育相关疾病的诊断中。
背景技术：
真核生物有机体的发育涉及生长及按照准确时空的细胞和组织分化。分化了的细胞形态和功能特异性是由特定基因的表达决定的。作为维持生命重要生理过程的造血涉及骨髓多能造血干细胞向具有不同形态及功能的血细胞的分化和发育成熟。虽然已提出不同的造血机制模型，但人们相信干细胞向某类细胞链系的分化决定和进一步分化发育成熟可能涉及许多基因的表达，由这些基因表达形成的调节网络最终决定了细胞的特异形态及功能。不正常的造血细胞分化可能导致严重的血液系统疾病，如在血液系统肿瘤中的分化阻抑或逆分化以及由于干/祖细胞增殖或分化异常导致的再生障碍性贫血。与造血细胞分化有关的重要基因及调节网络的确定对揭示细胞分化机制具有重要的理论意义，并可能对某些与造血相关的血液性疾病(如血液系统肿瘤、贫血和细胞较少症等)的防治产生实际意义。本发明涉及一种生物蛋白特异性抗体、它的制备方法及其应用，更具体地，本发明涉及一种编码锌指蛋白(HZF1)的特异性抗体、它的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。该抗体可应用于包括针对与HZF1功能和造血细胞分化及肿瘤相关疾病的诊断以及与HZF1功能和其他细胞和组织分化发育和肿瘤相关疾病的诊断中。
比本申请稍早提交的另一份专利申请中(发明名称为“锌指蛋白HZF1基因的功能及其应用”，申请号为200510109116X)，发明人对锌指蛋白HZF1的表达和功能做了深入的研究。利用细胞转染和报告基因技术证明HZF1蛋白定位于细胞核。这与从蛋白结构推断HZF1可能作为一个转录因子在基因转录调节中发挥作用相一致。用Northern杂交分析证明HZF1mRNA在广泛的组织和多种血液细胞系中有不同程度的表达，说明其可能在多种细胞和组织中行使功能。HZF1mRNA在处于红系和巨核系共同祖细胞阶段的红白血病K562细胞中表达很低，但随着hemin诱导的红系分化及PMA诱导的巨核系分化表达上调，暗示HZF1可能在红系分化和巨核细胞分化中发挥作用。应用反义核酸和RNA干扰技术，发现内源HZF1表达的抑制严重阻遏K562细胞向红系和巨核系两个方向的分化，证明了HZF1在红系和巨核系分化和发育中的重要作用。造血细胞分化发育的异常通常与某些疾病密切相关，如血液系统肿瘤(白血病)细胞的分化阻遏或逆向分化，再生障碍性贫血中的干/祖细胞分化阻遏等。影响HZF1功能和表达的因素有可能导致上述疾病，因此HZF1有可能成为控制和治疗某些白血病和再生障碍性贫血的靶基因。许多锌指蛋白，特别是C2H2型锌指蛋白已被证明影响多种组织和细胞的分化和发育，我们已证明HZF1在造血组织以外的其他组织表达，因此HZF1也可能在其他组织细胞的分化发育中具有重要作用。上述内容在此引入作为参考。
发明详述本发明涉及一种编码锌指蛋白(HZF1)的特异性多克隆抗体和单克隆抗体、它们的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。因此，本发明提供了一种利用HZF1抗体作为检测细胞和组织中HZF1表达水平的手段。
进一步地，本发明提供了一种与HZF1功能及红系分化和巨核细胞分化相关的肿瘤、贫血和红细胞或(和)巨核细胞减少症的诊断手段。
本发明还提供了一种与HZF1功能相关的其他疾病的诊断手段。
本发明中的术语“抗体”涉及所有可能类型的抗体，特别涉及多克隆和单克隆抗体，还涉及通过化学、生物化学或基因技术方法产生的抗体。制备这样的分子的方法对于本领域技术人员是公知的。
然而在抗体制备过程中，抗原的选择起了关键的作用。现有技术中已经鉴别了多个C2H2型锌指蛋白基因，近来从对基因组顺序的分析预测人类基因组包含700多个编码C2H2型锌指蛋白的基因(Nature409860-921，2001)。由于这些蛋白的锌指区氨基酸顺序高度保守，从而使得制备针对某一锌指蛋白的高特异性抗体具有较高难度。我们通过与GenBank中的顺序进行BLAST同源性比较，搜寻HZF1中低同源性顺序作为抗原。优选地使用非锌指部分序列作为抗原。把相应于这些氨基酸顺序的DNA顺序插入pET30a载体，感染大肠杆菌，获得了稳定的能诱导表达HZF1融合蛋白的克隆，进而制备和纯化了融合蛋白，免疫兔，最终获得针对HZF1蛋白的高效的和高特异性抗体。并进一步利用杂交瘤技术获得了针对HZF1蛋白的高效的和高特异性单克隆抗体。
附表(SEQUENCE LISTING)说明附表列出了构建的表达HZF1融合蛋白的重组质粒pET30aHZF1中的表达序列及相应氨基酸序列。从第142到720核苷酸为插入pET30a载体的HZF1cDNA中编码HZF1非锌指区的顺序(相应于融合蛋白中的第48到240氨基酸)。其余为原载体中的表达顺序。表达和纯化的这一融合蛋白被用作免疫抗原。
图1表明得到了优化表达HZF1融合蛋白的BL21菌株，HZF1融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。图中M代表蛋白marker，泳道1和3为IPTG诱导4h的菌裂解物，泳道2和4为未经IPTG诱导的菌裂解物。
图2表明使用BL21表达HZF1的菌株可诱导表达HZF1融合蛋白，采用Novagen公司的Ni柱可以很好地纯化HZF1蛋白，得到的蛋白纯度高。图中泳道1为通过Ni柱结合HZF1融合蛋白后的流出液，泳道2和3为使用Ni柱纯化后的HZF1融合蛋白。
图3显示了兔免疫血清的ELISA分析结果，表明由于用HZF1融合蛋白接种，兔产生了对其的强的免疫应答，而在免疫前的血清中没有发现对HZF1的免疫应答。
图4显示用Western blot方法，证明抗HZF1抗体没有和表达HZF1融合蛋白的菌株中的其它蛋白产生免疫应答，而只和HZF1融合蛋白发生免疫应答。图中泳道1为没有诱导的转化菌(pET30a-HZF1)，泳道2为IPTG诱导4h的转化菌(pET30a-HZF1)。
图5显示用HZF1抗体和Western blot方法，证明在经过hemin诱导或PMA诱导48h的人红白血病细胞K562(已知其表达高水平的HZF1mRNA)中检测到高水平HZF1蛋白，而在未诱导的K562细胞中(已知其表达很低水平的HZF1mRNA)未能检测到HZF1蛋白。说明抗HZF1抗体可以很好地识别和结合细胞和组织中表达的HZF1蛋白。
图6显示了单克隆抗体的ELISA分析结果，说明获得了高滴度的单克隆抗体。
图7显示用HZF1单克隆抗体和Western blot方法证明，在经过hemin诱导48h的人红白血病细胞K562(已知其表达高水平的HZF1mRNA)中检测到高水平HZF1蛋白，而在未诱导的K562细胞中(已知其表达很低水平的HZF1mRNA)未能检测到HZF1蛋白。说明获得的单克隆抗体特异地与HZF1蛋白结合而不与其它蛋白发生结合，能用于组织和细胞中HZF1蛋白的特异检测。
图8显示了K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子用HZF1抗体的western blot检测。转染了空载体pAVu6的稳定转染子细胞(对照)经hemin或PMA诱导48h后，可检测到高水平HZF1蛋白，而能够表达HZF1特异干扰RNA的K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞经hemin或PMA诱导48h后，未能检测到HZF1蛋白。结果说明抗HZF1抗体特异地与HZF1蛋白结合而不与其它蛋白发生结合。同时，当内源表达的HZF1蛋白被抑制时，抗HZF1抗体与HZF1蛋白的免疫应答也就消失。
图9显示了稳定转染子细胞用hemin诱导不同时间后联苯氨染色测定。图中空心方框代表K562pAVu6-HZF1i稳定转染子(图8已证明它们诱导后不表达HZF1)，实心方框代表K562pAVu6稳定转染子(图8已证明它们诱导后HZF1表达增加)。结果说明了HZF1蛋白表达参与促进肿瘤细胞系K562脱离分化阻抑状态，向红系方向继续分化。
图10显示了K562pAVu6HZF1i和K562pAVu6转染子细胞PMA诱导的巨核系分化。图中左侧峰代表二倍体细胞，右侧峰代表四倍体细胞。结果说明在K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞内RNA干扰对内源HZF1表达的抑制减弱了K562细胞PMA诱导的巨核系分化。同时说明了HZF1蛋白表达参与促进肿瘤细胞系K562脱离分化阻抑状态，向巨核系方向继续分化。
实施例使用的材料微量滴定板用于ELISA的Immuno Plate F96 MaxiSorp(Nunc)二抗HRP标记的羊抗兔抗体(Santa Cruz Biotechnology)ECL检测试剂盒用于western blot显色(Amersham)Ni柱Ni-NTA His·BindResins(Novagen)细胞系人红白血病细胞系K562；BALB/C骨髓瘤细胞系MOPC-21。
实验动物新西兰大白兔；纯种BALB/C小鼠0.2MPB溶液 由0.2M Na2HPO4和0.2M NaH2PO4溶液根据pH要求混合配制。
纯化缓冲液B8M尿素0.1MPB0.01M Tris-ClpH值8.0纯化缓冲液C8M尿素0.1MPB0.01M Tris-Cl
pH值6.3纯化缓冲液D8M尿素0.1MPB0.01M Tris-ClpH值5.9纯化缓冲液E8M尿素0.1MPB0.01M Tris-ClpH值4.5PBS-T NaCl 8.0gNa2HPO4·12H2O 2.9gKH2PO4，0.2gTween-20，0.5ml加ddH2O至100mlpH值7.4包被缓冲液 储备A液0.2M 21.2gNa2CO3加ddH2O到1000ml储备B液16.8gNaHCO3加ddH2O到1000ml将80ml(A)+170ml(B)+250mlddH2O混合pH值9.6底物 A液柠檬酸(无水)1.92g加ddH2O到1000mlB液Na2HPO4·12H2O7.16g加ddH2O到1000ml取2.43ml(A液)+2.57ml(B液)+5mlddH2O+30％H2O215μl+邻苯二胺4mg混合pH值5.0终止溶液 2M硫酸细胞裂解液A 1％Triton X-1000.15M NaCl0.01M磷酸钠(pH7.2)10％甘油10mM焦磷酸钠
1mM EDTA1mM dithiothreitol1mM phenylmethylsulfonyl fluoride1μg/ml leupeptin20μg/ml aprotinin2μg/ml pepstatinPI溶液 500μg/ml PI，溶于3.8×10-2M枸橼酸钠PH值7.0HAT培养液(在100ml完全培养液中，加入次黄嘌呤1.362mg，氨基喋呤0.0176mg，胸腺嘧呤0.388mg。)实施例1表达HZF1融合蛋白的工程菌的获得HZF1是一个锌指蛋白，其锌指区具有很高的保守性。为了产生抗HZF1特异性抗体，以pCMV-HZF1为模板(本申请专利发明人发现和保存的含HZF1cDNA的质粒)为模板，设计引物PCR扩增HZF1编码N端非锌指区序列(从第2氨基酸开始到第198氨基酸)。
PCR反应体系包括上下游引物P1和P2各20pmol(上游引物P1为GCA GAT ATC GAGCTC TCA GTT CCA G，含有EcoRV酶切位点；下游引物P2为TCA CT CGA GT GAG TGGACT TTC AGC，含有XhoI酶切位点)，模板pCMV-HZF1 0.02μg，10×PCR buffer 5μl，10nmol/L dNTP 1μl，pfu polymerase一个单位。PCR反应条件为95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共33个循环。利用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物，用EcoRV和XhoI双酶切。pET30a载体进行同样的双酶切。用连接酶于16℃连接目的片段与载体片段，转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取克隆，提取质粒，用PCR方法和DNA序列测定方法进行检测验证。附表列出了表达HZF1融合蛋白的重组质粒中的表达序列及相应氨基酸序列。
实施例2阳性克隆的蛋白表达分析为了优化HZF1融合蛋白的表达，挑取正确的阳性克隆单菌落接种于3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜。取过夜培养物30μl接种于3ml新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600nm为0.6，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养。在IPTG诱导4h后分别取1mL培养物，离心收集菌体，进行10％SDS-PAGE蛋白电泳分析。如图1所示，在1mmol/L IPTG中诱导4h后，HZF1融合蛋白得到了大量的表达。可以看到两个克隆用IPTG诱导后比在未诱导的样品中增加了一个约30kD并且表达量很高的条带，说明HZF1基因在原核中获得了高效的表达。
实施例3HZF1融合蛋白的表达和纯化为了纯化HZF1融合蛋白，大量培养表达融合蛋白的菌株，经IPTG诱导后用Novagen公司的Ni柱纯化上清中的HZF1融合蛋白。用200mLLB大量培养表达HZF1蛋白的阳性克隆，用1mmol IPTG诱导4h，收集细菌。细菌沉淀在冰上15min，重悬于纯化缓冲液B中每克5ml。搅拌15-60min在室温或轻柔的颠倒裂解，避免产生气泡，裂解液半透明时即可。在室温以10000g离心20～30min，保留上清。加1ml 50％Ni-NTA His·Bind浆到4ml裂解物中，室温下轻微振荡混合15～60min。仔细将裂解物-resin注入Ni柱，柱子的底盖关闭。打开底盖，收集流出的液体。保存流出液准备SDS-PAGE分析。用4ml纯化缓冲液C洗两遍，用0.5ml纯化缓冲液D洗脱目的蛋白4遍，接着再用0.5ml纯化缓冲液E洗脱4遍，收集洗脱液。10％SDS-PAGE分析纯化结果。如图2所示，可以看到在用Ni柱处理后的废液中几乎看不到HZF1融合蛋白，而从Ni柱上洗脱下来的蛋白全部是纯的HZF1蛋白。说明采用Ni柱纯化得到了高纯度的HZF1融合蛋白。
实施例4兔免疫血清多克隆抗体的制备用提纯的HZF1融合蛋白与完全弗式佐剂混合，超声乳化。采用背部皮下多点注射，免疫新西兰大白兔，3周后加强免疫，2周重新加强免疫，2周后再强化一次。于第4次加强免疫后一周收集兔血清。
实施例5用ELISA方法检测免疫血清的效价与前血清(pre-serum)相比较，针对纯化的HZF1蛋白，对回收并合并的兔免疫血清进行针对纯化的HZF1蛋白的分析，以测定接种过HZF1蛋白后的兔的总的免疫应答。借助于ELISA测试进行该项研究。纯化的HZF1融合蛋白用包被缓冲液(pH9.6)稀释至所需的蛋白浓度(100ng/100μl)，每孔加入100μl，4℃过夜，或37℃4h。将平板凹孔中的液体倾尽，用PBS-T洗涤三次。每孔加1％BSA200μl(用PBS-T配制)37℃1h，用PBS-T洗涤三次。将待检测血清用生理盐水1∶100到1∶150000稀释。100μl/孔4℃过夜用PBS-T洗涤三次。每孔加入100μl用PBS-T配制的以1/1000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，37℃2h，用PBS-T洗涤三次。每孔加入底物缓冲液100μl，37℃30min。加入50μl 2M H2SO4终止反应。用酶标仪测490nm光密度。抗血清测定值减去相应稀释倍数的免疫前的血清吸收值大于0.2时为阳性。图3显示了该项实验的结果由于用HZF1蛋白接种，兔产生了对其的强的免疫应答，而在前血清中没有发现抗HZF1抗体。抗体效价在1∶100000以上。
实施例6用HZF1抗体多克隆抗体分析HZF1融合蛋白工程菌中的蛋白为了检测抗血清的特异性，首先对表达HZF1融合蛋白的菌株的IPTG诱导前后的裂解物上清进行比较。借助于Western Blot检测进行该项研究。用5mL LB培养表达HZF1蛋白的阳性克隆，用1mmol IPTG诱导4h，收集细菌。用5mL LB培养表达HZF1融合蛋白的阳性克隆。在没有IPTG诱导的条件下培养4h，收集细菌，作为对照。用超声裂解两种样品细菌，取得上清进行SDS-PAGE电泳。用电转移法将蛋白转移到PVDF膜上，用10mL 5％的脱脂奶粉封闭。一抗为1∶10000兔抗人HZF1免疫血清。二抗为1∶2000HRG标记的羊抗兔IgG。使用ECL Western Blotting检测试剂盒显影。图4显示了该项实验的结果在IPTG诱导的细菌总蛋白中检测到HZF1表达，而在未用IPTG诱导的细菌总蛋白中没有检测到HZF1蛋白。结果说明HZF1抗体只和HZF1融合蛋白发生免疫应答，而不与菌珠中表达的其它蛋白产生免疫应答。
实施例7用HZF1抗体检测细胞中HZF1蛋白的表达为研究是否在内源表达HZF1蛋白的人细胞中，抗HZF1的抗体只和HZF1蛋白发生免疫应答。为了该目的，使用了经过hemin诱导的和PMA诱导48h的人红白血病细胞系K562(表达高水平的HZF1mRNA)。也试验了未诱导的人红白血病细胞系K562(表达很低水平的HZF1mRNA)作为对照。K562细胞培养于1640中，每100ml1640完全培养液中加入10ml胎牛血清，100U青霉素，100μg链霉素。培养条件为37℃，5％CO2及饱和湿度。向处于对数生长期的K562中加入40μmol/L hemin或5ng/mlPMA诱导48h。收集细胞，将细胞在200μl冰预冷的细胞裂解液A中重悬，使细胞裂解，进行和实施例6相同方法的westernblot分析。图5显示了实验的结果抗HZF1抗体特异地与HZF1蛋白结合，而不与其它蛋白发生结合，证明了HZF1抗体的高度特异性。
实施例8HZF1单克隆抗体的制备8.1.免疫动物的选择与抗原选择纯种BALB/C小鼠，用上述纯化的融合蛋白免疫动物。
8.2细胞融合使用BALB/C骨髓瘤细胞系MOPC-21，用小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞。
制备饲养层细胞取纯种BALB/C系小鼠，6-10周龄处死浸泡在75％酒精3-5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5ml预冷的培养液，反复冲洗，吸出冲洗液，冲洗液放入10ml离心管，1200rpm离心5-6min，用含20％NCS或FCS的培养液悬浮，调整细胞数至1×105，加入96孔板，100μl每孔放入37℃CO2培养箱培养。
制备免疫脾细胞最后一次加强免疫3天后处死小鼠，无菌取脾脏，培养液清洗脾脏研碎，过不锈钢筛网离心，细胞用培养液洗2次取108脾脏细胞备用。
制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，取107细胞备用。
融合步骤骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1∶10或1∶5的比例混合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心1200rpm，8min，弃上清；90s内加入37℃预温的1ml45％PEG溶液，边加边摇，37℃水浴90s；加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；以800rpm离心，6min。弃上清。细胞用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬；将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培养板内，每孔100ul，放入37℃5％CO2培养箱培养。
细胞在HAT培养液(内含完全培养液100ml，次黄嘌呤1.362mg，氨基喋呤0.0176mg，胸腺嘧锭0.388mg)中培养，以选择杂交瘤细胞(骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。)8.3抗体的检测用ELISA实验检测抗体的产生。
8.4杂交瘤的克隆化与单克隆的选择用软琼脂平板法将抗体阳性孔进行克隆化，挑选单个克隆，并通过ELISA实验检测筛选。选择到一株抗体滴度高的克隆。
实施例9单克隆抗体的大量生产及鉴定用体外培养法将选择的杂交瘤细胞在体外大规模培养，从细胞培养液中就能提取大量的单克隆抗体。把杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖，再从小鼠腹水中提取单克隆抗体，进行和实施例5相同的ELISA实验测定，确定抗体滴度在50000以上(图6)。
用获得的单克隆抗体对细胞蛋白进行和实施例6相同的western blot检测，证明能够特异检测HZF1蛋白(图7)。
实施例10用HZF1抗体检测K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞中HZF1蛋白表达进一步研究在人细胞系中内源HZF1蛋白表答的变化是否可以为抗HZF1的抗体识别。为了该目的，使用了经过hemin或PMA诱导的转染了pAVu6HZF1i质粒的人红白血病细胞系K562(HZF1蛋白的内源表达被抑制)。也试验了用hemin或PMA诱导的转染了pAVu6质粒的K562作为对照。根据HZF1cDNA 5’端非锌指区的一段序列设计siRNA(AATGTCGACCTTCACAAGGAAGACATTCACCTCTGAATGTCTTCCTTGTGAAGTTTTTCTAGAATA)，插入到真核表达载体pAVu6中，构建针对HZF1的RNA干扰质粒pAVu6HZF1。大量提取纯化pAVu6HZF1i质粒，转染K562细胞，48h后用500μg/ml G418筛选，得到4个稳定转染子库(K562pAVu6HZF1i-1～4)。同时用pAVu6转染K562细胞，获取4个稳定转染子库(K562pAVu6-1～4)作为对照。
K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i细胞培养于1640中，每100ml1640完全培养液中加入10ml胎牛血清，100U青霉素，100μg链霉素。培养条件为37℃，5％CO2及饱和湿度。向处于对数生长期的K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i中加入40μmol/L hemin或5ng/mL PMA诱导48h。收集细胞，将细胞在200μl冰预冷的细胞裂解液A中重悬，使细胞裂解，从稳定转染子细胞提取蛋白，用BCA法定量。进行和实施例6相同方法的western blot分析。图8显示了实验结果抗HZF1抗体特异地与HZF1蛋白结合而不与其它蛋白发生结合。同时，当内源表达的HZF1蛋白被抑制时，抗HZF1抗体与HZF1蛋白的免疫应答也就消失。
实施例11实验K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子hemin诱导的红系分化能力为了研究HZF1蛋白在细胞分化和肿瘤中的可能作用，首先分析红白血病细胞系K562向红系分化时的情况。按实施例10描述的方法培养K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞，加入40μmol/L hemin诱导。每隔12h使用联苯氨染色分析红系分化情况。在50μl(50μg/ml)联苯胺中加入1μl 30％过氧化氢混匀即为染色液。取少量细胞，离心收集，PBS洗一遍后，重悬在100μlPBS中，取81μl上述细胞悬液加入9μl染色液混匀后，放置3-5min，然后取部分细胞涂片观察，计数。一般计200个细胞，算出染色阳性细胞的百分比。图9显示了该项实验的结果K562pAVu6HZF1i转染子细胞在hemin诱导下联苯氨阳性细胞比例没有显著的增加，而K562pAVu6转染子细胞在hemin的诱导下联苯氨阳性的细胞比例明显升高。这说明K562pAVu6转染子hemin诱导的红系分化特性没有改变，而K562 pAVu6-HZF1i转染子细胞hemin诱导的红系分化被抑制。这说明HZF1表达阻遏严重抑制红系分化，也可由此推断HZF1蛋白表达的增加参与促进肿瘤细胞系K562脱离分化阻抑状态，向红系方向继续分化。
实施例12实验K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子PMA诱导的巨核细胞分化能力为了检测HZF1内源表达的抑制是否影响K562细胞PMA诱导的巨核系分化，我们将稳定转染子细胞用5ng/ml PMA诱导48h后用PI进行染色，然后用流式细胞仪分析细胞的多倍性(Ploidy)。按实施例10描述的方法培养K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞，加入5ng/mLPMA诱导48h后收集细胞，用PBS洗两遍，过400目网使细胞成单个细胞，计数。5ng/mLPMA诱导用500μlPBS重悬细胞。逐滴加入5ml预冷的无水乙醇，边加边震荡，以防细胞成团快，置4℃固定过夜。取上述固定好的细胞(5×106)，于15ml离心管中，1000rpm离心，去乙醇。用PBS重悬细胞，加入1％BSA或小牛血清，1000rpm离心，去上清，重复一遍。沉淀用适量含1％BSA或小牛血清的PBS重悬。加入100μl10XPI溶液(500μg/ml PI，溶于3.8×10-2M枸橼酸钠，pH7.0)。加入100μl RNaseA(10mg/ml)，37℃温育30min。用PBS漂洗细胞。用流式细胞仪检测。图10显示了该项实验的结果K562pAVu6HZF1i和K562pAVu6转染子细胞在没有PMA诱导的情况下二倍体细胞远多于四倍体细胞。PMA诱导后K562pAVu6转染子细胞的四倍体细胞大幅增加，超过了二倍体细胞。而PMA诱导的K562pAVu6HZF1i转染子四倍体细胞比例虽然增加，但是二倍体仍然多于四倍体。这说明RNA干扰对内源HZF1表达的抑制减弱了K562细胞PMA诱导的巨核系分化。也可以由此推测HZF1蛋白表达的增加参与促进肿瘤细胞K562脱离分化阻抑状态，向巨核系方向继续分化。
SEQUENCE LISTING<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>锌指蛋白HZF1抗体<140>2005101093930<141>2005-10-19<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>777<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac120gacgacaagg ccatggctga tatcgagctc tcagttccag gaccatcccc ctggacccct180gcagcccagg cccgtgtgag agatgctcct gctgtgaccc accctggatc tgcagcctgt240ggtaccccct gctgtagtga tactgagctg gaagccatct gccctcacta tcagcagcca300gcagattgtg acaccaggac tgaagacaag gagtttcttc acaaggaaga cattcatgaa360gatttggaat cacaggcaga aatatcagaa aactatgctg gtgatgtttc ccaggtaccc420gagcttggag atctgtgtga tgatgtatca gaaagagact ggggagtccc cgaaggcagg480aggctgccac agtccctctc ccaggagggg gacttcacac cagctgccat ggggctcctt540aggggcccct taggggagaa agatctggac tgtaatggtt ttgacagtcg cttcagtctg600agcccaaacc tgatggcatg tcaggaaatc cctacagaag agaggccaca tccatatgac660atgggtggcc agagtttcca gcacagtgtg gacctaactg gtcatgaggg ggttcccaca720gctgaaagtc cactcactcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaa 777<210>2<211>258<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser1 5 10 15Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp20 25 30Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile35 40 45
Glu Leu Ser Val Pro Gly Pro Ser Pro Trp Thr Pro Ala Ala Gln Ala50 55 60Arg Val Arg Asp Ala Pro Ala Val Thr His Pro Gly Ser Ala Ala Cys65 70 75 80Gly Thr Pro Cys Cys Ser Asp Thr Glu Leu Glu Ala Ile Cys Pro His85 90 95Tyr Gln Prn Pro Ala Asp Cys Asp Thr Arg Thr Glu Asp Lys Glu Phe100 105 110Leu His Lys Glu Asp Ile His Glu Asp Leu Glu Ser Gln Ala Glu Ile115 120 125Ser Glu Asn Tyr Ala Gly Asp Val Ser Gln Val Pro Glu Leu Gly Asp130 135 140Leu Cys Asp Asp Val Ser Glu Arg Asp Trp Gly Val Pro Glu Gly Arg145 150 155 160Arg Leu Pro Gln Ser Leu Ser Gln Glu Gly Asp Phe Thr Pro Ala Ala165 170 175Met Gly Leu Leu Arg Gly Pro Leu Gly Glu Lys Asp Leu Asp Cys Asn180 185 190Gly Phe Asp Ser Arg Phe Ser Leu Ser Pro Asn Leu Met Ala Cys Gln195 200 205Glu Ile Pro Thr Glu Glu Arg Pro His Pro Tyr Asp Met Gly Gly Gln210 215 220Ser Phe Gln His Ser Val Asp Leu Thr Gly His Glu Gly Val Pro Thr225 230 235 240Ala Glu Ser Pro Leu Thr Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Set245 250 255Gly Cys
权利要求
1.锌指蛋白HZF1高效性和特异性抗体的制备方法。
2.如权利要求1的HZF1高效性和特异性抗体的制备方法，主要指利用HZF1蛋白顺序中特异性高的肽段作为抗原，获得高效性和HZF1特异性抗体。
3.如权利要求2的制备方法，包括利用HZF1蛋白顺序中特异性高的肽段作为抗原，获取多克隆抗体和单克隆抗体的方法。
4.如权利要求2的制备方法，其中高特异性肽段包括用基因工程方法获得肽段和用化学合成的方法制备的肽段。
5.如权利要求1-4任一项的制备方法，其中锌指蛋白HZF1的特异性抗体的抗原选自非锌指区的特异性序列。
6.如权利要求5的制备方法，其中非锌指区是指除去锌指区后HZF1蛋白的序列的全部或部分。
7.如权利要求1所述的锌指蛋白HZF1的特异性抗体在制备用于诊断与HZF1功能相关疾病的试剂中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于所述的相关疾病是与HZF1表达和功能相关的红系细胞和巨核细胞分化相关的肿瘤、贫血及红系细胞或(和)巨核细胞减少症，以及与HZF1功能和其他细胞和组织分化发育相关的疾病。
全文摘要
本发明涉及一种生物蛋白特异性多克隆抗体和单克隆抗体、它们的制备方法及其应用。更具体地，本发明涉及锌指蛋白HZF1的特异性多克隆抗体和单克隆抗体、它们的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。该抗体可应用于与HZF1功能和红系细胞和巨核细胞分化相关的肿瘤、贫血及红系细胞或(和)巨核细胞减少症的诊断以及与HZF1功能和其他细胞和组织分化发育相关疾病的诊断中。
文档编号G01N33/574GK1951966SQ20051010939
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者张俊武, 彭瀚, 杜占文, 张昕 申请人:中国医学科学院基础医学研究所