一种水稻开花素重组蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括RNA提取、重组载体制备、基因工程菌获得、重组蛋白分离纯化等步骤；实验证明，在本发明低温条件16～20℃下，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。本发明首次尝试了对植物开花素蛋白OsHd3a的原核表达，成功克隆了OsHd3a基因并构建了表达载体，重组质粒经酶切鉴定，再经测序确认序列正确，最后经过Ni-NTAResin分离纯化得到重组蛋白Hd3a，为将其应用于植物开花生理过程的调控提供了基础，对植物生产实践具有重要的意义。
【专利说明】一种水稻开花素重组蛋白的制备方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水稻开花素重组蛋白的制备方法。
(二)【背景技术】
[0002]开花是绿色植物特有的现象，开花植物使得世界绚丽多彩。多年来，科学家一直在对植物开花机理进行不懈的探索，并希望对植物开花的周期进行调控。1937年，俄国植物生理学家Mikhail Chailakhyan提出开花素(Florigen)假说,认为植物叶片接收到光信号后会产生某种物质并传递到植物茎顶端诱导花芽产生。利用嫁接等研究方法也进一步发现植物叶子可以通过感受日昼长短变化来感受季节变化，并因此而产生某种物质，引发一种从叶到茎尖的长距离信号传导，最终促进开花。这种可能的物质被称为开花素，但是几十年来开花素的化学本质一直没有被鉴定。最近几年在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oriza sativa)中同时发现了开花素，它是一种可移动的蛋白分子，参与花器官形成的诱导。在拟南芥中开花素是由叶片中Flowering Locus T(FT)基因编码的FT蛋白，可通过维管系统运送至茎尖，激活其它开花相关基因并引起开花。水稻中的FT同源蛋白是0sHd3a，能从叶中传递到莖尖分生组织从而导致水稻开花。在番爺(Solanum Iycopersicum)中也存在 FT 同源基因 SINGLE-FLOWER TRUSS (SFT)，在烟草(Nicotiana tabacum)或番茄中过量表达FT或SFT基因都会促进提前开花。
[0003]开花素相关的研究结果给我们利用开花的分子机制对植物开花进行调控提供了重要启示，开花素既然是叶片中产生并可以移动的蛋白，那么就可以通过人工的方法生产开花素蛋白并施用于植物，如果可以应用于农作物、花卉观赏园艺等植物进行开花周期的调控，那么具有巨大的应用前景和商业价值。植物的开花年限，既是科学家研究的热点也是实践生产中需要解决的问题。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种水稻开花素重组蛋白的制备方法。
[0005]本发明采用的技术方案是:
[0006]一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括:
[0007](I)取开花期水稻叶片，用液氮研磨后，按常规方法提取总RNA ；
[0008](2)以水稻总RNA为模板，用扩增弓I物进行RT-PCR，PCR产物经电泳后凝胶回收，回收产物克隆至PMD18-T，获得重组载体pMD18-T-0sHd3a ；
[0009]所述扩增引物序列如下:
[0010]h游引物:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’ ；
[0011]下游引物:5’-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，；
[0012]扩增得到的核苷酸序列如下:
[0013]ATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAGGGACCCTCTTGTGGTT GGTAGGGTTGTGGGTGATGTGCTGGACGCGTTCGTCCGGA GCACCAACCTCAAGGTCACCTATGGCTCCAAGACCGTGTC CAATGGCTGCGAGCTCAAGCCGTCCATGGTCACCCACCAG CCTAGGGTCGAGGTCGGCGGCAATGACATGAGGACATTCT ACACCCTTGTGATGGTAGACCCAGATGCACCAAGCCCAAG TGACCCTAACCTTAGGGAGTATCTACATTGGTTGGTCACTG ATATTCCTGGTACTACTGCAGCGTCATTTGGGCAAGAGGTG ATGTGCTACGAGAGCCCAAGGCCAACCATGGGGATCCACC GGCTGGTGTTCGTGCTGTTCCAGCAGCTGGGGCGTCAGAC AGTGTACGCGCCCGGGTGGCGTCAGAACTTCAACACCAA GGACTTCGCCGAGCTCTACAACCTCGGCTCGCCGGTCGCC GCCGTCTACTTCAACTGCCAGCGCGAGGCAGGCTCCGGCG GCAGGAGGGTCTACCCCTAG ；
[0014]其编码的氨基酸序列如下:
[0015]MAGSGRDRDPLVVGRVVGDVLDAFVRSTNLKVTYGSKTVS NGCELKPSMVTHQPRVEVGGNDMRTFYTLVMVDPDAPSPS DPNLREYLHWLVTDIPGTTAASFGQEVMCYESPRPTMGIHRL VFVLFQQLGRQTVYAPGffRQNFNTKDFAELYNLGSPVAAVY FNCQREAGSGGRRVYP ；
[0016](3)测序正确的重组载体1?18-1'-08!1(13&经限制性内切酶恥61/10 I酶切后，将含目的基因片段插入pET28b，构建重组表达载体PET28b-0sHd3a，经过测序验证后转入大肠杆菌菌株BL21 (DE3)；
[0017](4)含重组质粒的表达菌株BL21 (DE3)在37°C活化培养后，挑取单菌落转入LB液体培养基中37°C振荡培养12h，所得菌液按照1:100体积比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液体培养基中，37°C、200r/min培养至OD6tltl为0.4，加入终浓度0.50mmol/L的IPTG，20°C诱导培养至OD6c?为1.0 ;实验证明，在本发明的温度条件(20°C)下，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。
[0018](5)步骤(4)所得菌液经分离纯化，得到所述水稻开花素重组蛋白。
[0019]优选的，为增加可溶性蛋白的含量，步骤(4)诱导培养时培养基中还可添加有2g/L的葡萄糖。
[0020]本发明的有益效果主要体现在:本发明首次尝试了对植物开花素蛋白0sHd3a的原核表达，成功克隆了 0sHd3a基因并构建了表达载体，重组质粒经酶切鉴定，再经测序确认序列正确，最后经过N1-NTA Resin分离纯化得到重组蛋白Hd3a，为将其应用于植物开花生理过程的调控提供了基础，对植物生产实践具有重要的意义。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为重组质粒pET-28b_0sHd3a的酶切结果分析；M:marker ; 1:重组质粒pET-28b_0sHd3a ；
[0022]图2为亲和层析后目的蛋白SDS-PAGE图；
[0023]图3为IPTG诱导浓度的优化；IPTG浓度为:1:不加IPTG的对照；2:0.25mmol/L ；3:0.SOmmoI /I, ；4: 1.00mmol/L。
(五)【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0025]实施例1:
[0026]一、获得0sHd3a基因的编码区DAN片段；
[0027]水稻总RNA提取采用RNAiso Reagent试剂盒(Takara公司)进行:取开花期水稻叶片lOOmg，用液氮研磨后，加入提取液按照说明书提取总RNA。提取的总RNA加入DNase去除基因组DNA，进行氯仿抽提纯化后溶于RNase free ddH20，随后参照PrimeScript RT-PCRKit使用说明合成cDNA —链。水稻开花调控基因0sHd3a扩增的正向引物为:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’，下划线为限制酶 Nde I。反向引物为:5’ -GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3’，下划线为限制酶Xho I。PCR产物经电泳后进行凝胶回收，回收产物克隆至PMD18-T (上海生工)载体进行测序。
[0028]二、构建含有目的基因的大肠杆菌重组表达载体PET28b-0sHd3a ;测序正确的pMD18-T-0sHd3a载体和pET28b(Novagen)分别经限制性内切酶Ndel/Xhol酶切后，连接，将目的基因片段(SEQ ID N0.3)插入pET28b，构建pET28b-0sHd3a载体，获得目标基因融合有His-tag的重组表达载体。pET28b-0sHd3a经过测序验证后转入大肠杆菌菌株BL21 (DE3)进行重组蛋白(SEQ ID N0.4)的表达研究。重组载体的酶切验证图见附图1。
[0029]三、重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，获得基因工程菌。
[0030](I)菌株的活化及扩大培养
[0031]LB液体培养基配制:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化钠IOg,蒸懼水1000mL。
[0032]LB平板即LB固体培养基为LB液体培养基添加15g/L琼脂。
[0033]取于_70°C保存的大肠杆菌BL21 (DE3)菌种，用灭菌牙签沾取冰渣，划线于LB平板(LB液体培养基+15g/ L琼脂)上，.于37°C培养箱培养16小时。用灭菌牙签挑取单菌落放入含5mL LB液体培养基的试管中，于30°C摇床(转速200r/min)培养12小时。取500 μ L试管中菌液，转入含50mL LB液体培养基的锥形瓶中，37°C摇床(转速200r/min)培养3小时，此时OD6qq=0.4左右。
[0034](2)感受态细胞的制备
[0035]培养液冰浴10分钟，将90mL培养液转入2支50ml离心管中，4°C，4500r/min下离心5分钟，弃上清液。用30mL0.lmol/L CaCl2溶液温和吸打悬浮沉淀，4°C，4500r/min下离心3分钟，弃上清液。用IOmL0.lmol/L CaCl2溶液温和吸打悬浮沉淀，冰浴30分钟，4°C，4000r/min下离心3分钟，弃上清液。用2mL0.lmol/L CaCl2溶液温和吸打悬浮沉淀，即制成感受态细胞。
[0036](3)感受态细胞的转化
[0037]取感受态细胞菌液50 μ L，加入I μ L含有目的基因的质粒pET28b_0sHd3a，轻轻吸打混匀，冰浴20分钟。42°C热击60秒，迅速置于冰上2分钟。加入LB液体培养基200 μ L，37°C培养箱培养I小时。取培养后的菌液200 μ L，涂布于含卡那霉素的LB平板(卡那霉素含量50μ g/mL)，37°C培养箱培养12小时。
[0038]四、重组蛋白分离纯化
[0039]2XYT培养基配制:蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaC15g，蒸馏水lOOOmL，pH7.0。
[0040]含重组质粒以及空质粒的表达菌株BL21 (DE3)在37°C活化培养后，挑取单菌落转入含5mL2XYT培养基(含卡那霉素50μ g/mL)中37°C振荡培养12h，取菌液500 μ L加入到含50mL2XYT培养基(含卡那霉素50 μ g/mL)中，37°C摇床(转速200r/min)培养OD6tltl至
0.4，加入IPTG (0.50mmol/L)诱导，20°C诱导培养OD6tltl至1.0。离心收集菌体，保留上清液用于检测。菌体沉淀加入BugBuster protein extraction reagent (Merck公司)进行温和吸打悬浮，室温孵育20min后于4°C、14000r/min离心20min，上清液和沉淀分别保存备用。
[0041]经SDS-PAGE电泳检测确定目标蛋白所在的组分后，上清液采用His bindpurification kit(Merck公司)进行N1-NTA Resin亲和柱层析,方法按照说明书进行。重组蛋白由唑洗脱后在4°C条件下，IOmmoI/L磷酸缓冲液PBS (pH7.0)中进行透析，更换磷酸缓冲液4次,共透析16h以除去咪唑和NaCl等成分,透析后的蛋白经Bradford法定量后进行电泳分析，电泳图中可以观察到重组蛋白目的条带(图2)。上清液中蛋白来自于细胞内部，同时表明了目标蛋白主要是胞内的可溶性表达。可以看出利用N1-NTA Resin能成功纯化出重组目标蛋白，目标带相对较纯，这说明his-tag能有效的与镍柱结合，达到高效分离纯化植物开花素蛋白的目的。
[0042]本发明研制的过程中开始发现蛋白表达量低，且不可溶的包涵体较多，经过改进和条件优化，提高了蛋白表达量以及可溶性。
[0043]蛋白表达条件的优化:
[0044]取于_70°C保存的转质粒的BL21 (DE3)菌株，用灭菌牙签分别划线于LB平板(卡那霉素含量50 μ g/mL), 37°C培养箱培养12小时。用灭菌牙签挑取单菌落，放入含5mL2X YT培养基(含卡那霉素5(8/1)的试管中，371:摇床(转速20017/111)培养12小时。取试管中的菌液500 μ L，分别加入到含50mL2XYT培养基(卡那霉素含量50 μ g/mL)的锥形瓶中，37°C摇床(转速200r/min)培养2.5小时，此时OD6tltl=0.4左右。以不加IPTG为对照，进行IPTG条件优化，IPTG设置系列浓度梯度，包括从0.25,0.50，1.00mmol/L，诱导时间3小时和5小时，20°C摇床(转速200r/min)诱导。取ImL菌液于EP管中，10000r/min离心I分钟，去上清液。加100 μ L PBS悬浮沉淀，即制成电泳样品。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对样品进行电泳。蛋白电泳结果见图3。
[0045]结果显示，0.50mmol/L IPTG能显著诱导重组蛋白的产生，大于此浓度后，对蛋白表达量的诱导效果不大，因此采取浓度为0.50mmol/L的IPTG进行重组蛋白诱导。而在温度为20°C条件下培养，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。
[0046]实施例2:重组开花素蛋白对开花植物番茄催花的生物测定
[0047]以未开花的苗龄一致的番茄幼苗(番茄品种浙杂502)进行重组蛋白活性生物测定。供试番茄幼苗分三组，注射重组开花素蛋白(SEQ ID N0.4)处理组、注射不含蛋白的缓冲液处理组、自然培养的不处理的空白对照组，从叶脉或叶柄处进行注射，重组蛋白的最终注射用量分别为每株2、10、50μ8，不含缓冲液为lOmmol/L磷酸缓冲液PBS (pH7.0)，每个处理有20株苗。处理的和未处理的植物苗在相同的培养条件下培养，统计自然苗及处理苗的开花时间、开花率等开花情况。结果表明，各种处理的苗最终开花率接近，达到95%以上。但是，蛋白处理组的开花率达到90%以上的时间比未处理的自然苗和缓冲液处理的对照苗平均提前了 5天，表明重组开花素蛋白对所测番茄开花进程有一定的促进作用。
【权利要求】
1.一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括: (1)取开花期水稻叶片，用液氮研磨后，提取总RNA； (2)以水稻总RNA为模板，用扩增引物进行RT-PCR，PCR产物经电泳后凝胶回收，回收产物克隆至PMD18-T，获得重组载体pMD18-T-0sHd3a ； 所述扩增引物序列如下: 上游引物:5，-CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3，； 下游引物:5，-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，； (3)测序正确的重组载体pMD18-T-0sHd3a经限制性内切酶Ndel/Xhol酶切后，将含目的基因片段插入pET28b，构建重组表达载体PET28b-0sHd3a，经过测序验证后转入大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)； (4)含重组质粒的表达菌株BL21(DE3)在37°C活化培养后，挑取单菌落转入LB液体培养基中37°C振荡培养12h，所得菌液按照1:100体积比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液体培养基中，37°C、200r/min培养至OD6tltl为0.4，加入终浓度0.50mmol/L的IPTG，20°C诱导培养至OD6tltl为1.0 ; (5)步骤(4)所得菌液经分离纯化，得到所述水稻开花素重组蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)诱导培养时培养基中还添加有2g/L的葡萄 糖。
【文档编号】C12N15/70GK103436551SQ201310346525
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】朱廷恒, 王渭霞, 严宏波, 汪琨, 崔志峰 申请人:浙江工业大学