与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中的蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及与水稻 粒形和株高相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
水稻作为一种重要的粮食作物，其产量的重要性不言而喻。籽粒的重量(一般用 千粒重表示)是水稻产量的三大构成因素之一；籽粒形状和大小直接影响了籽粒的重量， 是水稻产量的决定因素之一。同时，籽粒的形状和大小还直接决定碾净去糠大米的外观和 大小，因而又是稻米品质的决定因素之一。植株高度是水稻株型建成的重要农艺性状之一， 直接影响水稻品种的抗倒性能和丰产潜力。由此可见，分离和鉴定与水稻粒形和株高相关 的功能基因，对于利用基因工程技术改良水稻性状，从而提高和稳定水稻产量、提升稻米外 观品质具有重要的意义。目前在水稻中已清楚鉴定的能同时影响籽粒形状和株高的基因并不多，研究得 比较深入的有DWARF1、DWARF4和DWARF11等，这些基因通过各种各样的分子途径参与调 控籽粒形状和株高。DWARFl基因编码GTP结合蛋白α亚基，参与赤霉素信号转导途径， 从而在植物生长和发育中起作用，影响水稻植株的株高和籽粒的大小(Ueguchi-Tanaka 等.2000.Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 :11638_11643)。 DWARF4和DWARFl 1编码细胞色素P450，通过参与油菜素内酯的合成过程，影响水稻植株的 株高和籽粒的形状大小(Tanabe 等.2005. Plant Cell. 17 776-790 ；Sakamoto 等.2006. Nature Biotechnology. 24 105-109)。TUDl基因编码含有U_box结构域的蛋白，也是 一个控制水稻株高和籽粒大小的基因，其具体功能和调控途经还不清楚(专利申请号 200810102797. 0)。

发明内容
本发明的一个目的是提供与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与水稻粒形和株高相关的蛋白，名称为0sKineSin-13A，来源于水 稻(Oryza sativa L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与水稻粒形和株高相关的由(a)衍生的蛋白质。序列表中的序列1由819个氨基酸残基组成。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述(a)中的0SKineSin-13A蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生 物表达得到。上述(b)中的0sKinesin-13A衍生蛋白可人工合成，也可通过将序列表中序 列2所示的DNA序列中缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因，再进行生物表达得到。与水稻粒形和株高相关蛋白的编码基因具体可为如下1)_3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2 ；2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因。3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列表中的序列2由2460个核苷酸组成，其编码序列为自5’末端第1-2460位碱 基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的0sKinesin-13A蛋白。上述严格条件可为在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，65°C下进 行DNA或RNA杂交实验并洗膜。含有上述与水稻粒形和株高相关蛋白的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基 因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pUN1301载体的多克隆位点间插入上述与水稻粒 形和株高相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是通过抑制所述编码基因的表达水平， 得到转基因植物。所述转基因植物为下述1)、2)或3)的植物1)与目的植物相比，籽粒变为圆形且植株矮化；2)与目的植物相比，籽粒变为圆形；3)与目的植物相比，植株矮化。所述目的植物为转基因受体植物。上述抑制所述编码基因的表达水平具体可通过RNA干扰实现。所述RNA干扰是通过将双链RNA的编码DNA导入目的植物中实现的；其中，所述双 链RNA的一条链的核苷酸序列是将序列2的第1587-2195位碱基序列中的T替换为U得到 的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。所述双链RNA的编码DNA的是如下双链DNA片段SEQ正向-X-SEQ颇；其中，SEQ正 向的核苷酸序列是序列2的第1587-2195位碱基序列；与所述向互补；X是 3￡0_与SEQ_之间的间隔序列，X与所述SEQf^P SEQ均不互补。所述RNA干扰是将RNA干扰载体导入目的植物中，得到转基因植物。所述RNA干扰载体是通过如下方法构建的将序列表中序列2第1587-2195位碱基序列所示的DNA片段插入pTCK303质粒的 Spe I和Sac I酶切位点之间得到重组质粒pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列；将序列表 中序列2所示的第1587-2195位碱基序列反向插入pTCK303-0sKinesin_13A-正向序列质 粒的Kpnl和BamH I酶切位点之间，构成所述干扰重组表达载体。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。本发明中与水稻粒形和株高相关的蛋白主要控制水稻粒形和株高，通过RNA干扰 降低所述蛋白编码基因的表达水平，可得到籽粒变为圆形、植株矮化的水稻。因此利用该基 因可以培育籽粒为圆形、植株矮化的新型水稻品种，对提高和稳定水稻产量、提升稻米外观 品质具有重要的意义。


图1为水稻突变体sar、野生型、0sKinesin_13A基因的过量表达转基因sar突变 体植株以及RNA干扰抑制表达转基因植株在成熟期植株高度的比较。其中A为野生型，B为sar突变体，C为0SKineSin-13A基因过量表达的转基因sar 突变体植株；D为转化空载体对照的转基因sar突变体植株；E为0sKinesin-13A基因RNA 干扰抑制表达的转基因野生型植株；F为RNA干扰对照植株，比例尺为10cm。图2为水稻突变体sar、野生型、0sKinesin_13A基因的过量表达转基因sar突变 体植株以及RNA干扰抑制表达转基因植株的成熟籽粒的比较。其中A为野生型的成熟籽粒；B为sar突变体的成熟籽粒；C为0SKineSin-13A基 因过量表达的转基因sar突变体植株的成熟籽粒；D为转化空载体对照的转基因sar突变 体植株的成熟籽粒；E为RNA干扰对照植株的成熟籽粒；F为0sKinesin-13A基因RNA干扰 抑制表达的转基因野生型植株的成熟籽粒。图3为过量表达载体pUN1301-0sKinesin_13A的图谱。图 4 为 RNA 干扰载体 p0sKinesin_13A-RNAi 的图谱。其中 RNAi-sense 表示 0sKinesin_13A-正向序列片段，RNAi-antisense 表示 0sKinesin-13A-反向序列片段。图5为0sKineSin-13A基因在水稻中的表达模式分析。其中A为RT-PCR结果；B为实时荧光定量PCR结果。R(Root)为7天龄水稻幼苗 的根；B (Bud)，4mm长的幼芽；L (Leaf)为成熟叶；St (Stem)为拔节后的茎；F (Flower)为成 熟颖花；Sd(Seed)为授粉6天后的籽粒；C(Calli)为愈伤组织。图6为0sKinesin_13A抗体制备和特异性检测。其中A为0sKineSin-13A多克隆抗体与野生型水稻及sar突变体的幼苗及幼根总 蛋白进行蛋白免疫印迹杂交的结果；seedling，幼苗；root，根。B为微管蛋白Tubulin单克 隆抗体与野生型水稻及sar突变体的幼苗及幼根总蛋白进行蛋白免疫印迹杂交的结果。图7为0sKinesin-13A基因RNA干扰抑制表达转基因株系中内源0sKinesin_13A 基因表达量的半定量RT-PCR检测。其中，WT为野生型水稻，Ll至L7为7个独立的、0sKinesin_13A基因RNA干扰抑 制表达的转基因野生型水稻植株株系。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、与水稻粒形和株高相关的0sKineSin-13A基因的获得本发明首先通过6tlCo γ射线照射野生型水稻品种中花11 (李梅芳、周开达.2001. 水稻生物技术育种.北京中国农业科技出版社.27-29)的种子，种植经过照射的种子，从 其生长得到的植株中筛选获得到一个植株矮化(图1)且籽粒长度变短、形状变圆(图2中 A和B)的水稻突变体sar。然后利用微卫星标记和图位克隆技术，将sar突变体的突变位点 定位到水稻第5号染色体短臂的一段210kb的区段上，即两个微卫星标记RM405和RM7444之间。进而通过序列标记位点将突变位点精细定位到两个微卫星标记间的18kb区域内。 卞艮m禾(The Rice Genome Annotation Project Database,http://rice, plantbiology. msu. edu)，这一区域内只有一个编码基因；该基因序列对应于序列表中序列 2所示的核苷酸序列，编码具有819个氨基酸残基的蛋白质，对应于序列表中序列1所示的 氨基酸序列。6tlCo Y射线诱变导致的突变位点在该基因序列的第1306位，该位点的碱基A 发生了缺失，从而造成蛋白序列翻译从436位氨基酸残基之后开始移码，并在464位氨基酸 残基处提前终止。将该基因命名为0sKinesin-13A。
同时本发明制备了针对0sKineSin-13A蛋白的特异性多克隆抗体，通过Western blot对抗体的特异性进行验证。具体实施办法描述如下利用DNAstar软件对0SKineSin-13A蛋白序列进行综合分析，最终选取该蛋白序 列第662 676位共15个氨基酸残基的多肽作为抗原肽段。该段多肽具有良好的柔韧性、 高抗原指数、高表面可及性、高亲水性且无明显二级结构，适合作为抗原。将该肽段序列在 NCBI及TIGR水稻蛋白数据库中进行比对搜索，没有搜索到与该序列同源性高的其他蛋白， 说明该肽段是0sKinesin-13A蛋白特异性的。化学合成该肽段后偶联KLH载体，免疫新西 兰大白兔，获得0sKinesin-13A特异性的多克隆抗血清(抗体)。为验证制备的0sKineSin-13A多克隆抗体的特异性，用所述抗体对野生型水稻中 花11及sar突变体15天龄幼苗和幼根的总蛋白进行了 Western杂交验证。Western检测 结果显示(图6中A)，制备的0sKinesin-13A多克隆抗体与野生型幼苗及幼根的总蛋白进 行杂交时，可得到约90kDa的单一目标蛋白条带，而与sar突变体的幼苗及幼根总蛋白进行 杂交时，不能得到任何条带。由于选取0sKinesin-13A蛋白序列上第662 676位多肽片 段制备多克隆抗体，该抗体只特异性识别这15个氨基酸；野生型水稻的0sKinesin-13A蛋 白完整表达，包含了这一肽段，因而可被制备的抗体结合而显示出约90kDa的杂交条带；而 sar突变体表达的变异0sKinesin-13A蛋白是不完整，其翻译从436位氨基酸残基之后开始 移码并在464位氨基酸残基处提前终止，因而不包含上述的15个氨基酸残基的多肽，无法 与制备抗体结合，Western检测将无法显示出杂交条带。用Tubulin单克隆抗体同步进行 的杂交显示(图6中B)，上述四个总蛋白样品的Tubulin内标蛋白杂交带的亮度相似，说明 四个样品的总蛋白都没有降解且上样量相近。以上结果说明本发明制备的0sKinesin-13A 多克隆抗体能特异的与0sKinesin-13A蛋白结合，同时确定该抗体的效价为1 20，000。实施例2、0sKinesin-13A基因的功能互补验证本发明首先根据获得的0sKineSin-13A基因的序列信息(序列2)，设计了该核苷 酸序列的引物对，引物 1 :5，-ATAAGGATCCATGGGGGACTCCGGGGAC-3，禾口引物 2 5，-ACCGGAGCTCTTATCTGGAAGATTTCTT-3，，进行RT-PCR扩增合成0sKineSin-13A基因全序列。具体步骤为从野生型水稻中 花11的成熟花序中提取总RNA作为模板，在反转录酶的催化下合成第一链CDNA ；再以合成 的第一链cDNA为模板，上述引物1、引物2为引物对，在高保真的T4DNA聚合酶催化下完成 聚合酶链式反应(PCR)，扩增获得2. 47kb的0sKinesin-13A基因的全长双链cDNA产物，在 该基因序列两端各添加BamH I和Sac I酶切位点。合成的0sKineSin-13A基因全长产物经BamH I和SacI双酶切后，连接到双元载体 pUN1301(Zhen Wang 等，2004，Plant Molecular Biology R印orter，22 :409_417 ；陈惠、赵原和种康，2008，植物学通报，25 :322-331)的BamH I和Sac I位点之间，得到的连接产物 为0sKinesin-13A基因的过量表达载体pUN1301-0sKinesin_13A (图3)。连接产物经CaCl2 法转化到大肠杆菌DH5ci菌株中，涂布到含有卡那霉素(50yg/mL)的LB固体培养基上。 由于双元载体PUN1301上具有卡那霉素抗性基因(图3的Kanamycin R)，因此质粒成功转 化进入的大肠杆菌菌株将表达卡那霉素抗性基因而获得抗性，从而能在含有卡那霉素的LB 固体培养基上生长。生长出来的大肠杆菌单菌落(克隆)用上述的引物1、引物2进行PCR 验证，挑选出能扩增得到2. 47kbDNA片段的克隆；PCR验证的克隆再接种培养，用SDS碱裂 解法提取菌株中的质粒，提取的质粒用BamHI和SacI双酶切，能切出约2. 46kb片段的克隆 确定为阳性克隆。经PCR和酶切验证的大肠杆菌阳性克隆最终还进行了测序验证，证实菌 株中的质粒确实是pUN1301-0sKinesin-13A过量表达载体，且该载体上0sKinesin_13A基 因全长序列与序列2所示的核苷酸序列完全一致。构建好且测序验证正确的过量表达载体pUN1301-0SKineSin-13A(图3)通过冻融 法转化到农杆菌菌株EHA105中，涂布到含有利福平(25μ g/mL)和卡那霉素(50 μ g/mL)的 LB固体培养基上筛选阳性转化克隆，生长出来的农杆菌单克隆用上述大肠杆菌PCR鉴定法 进行检测和验证，能扩增得到2. 47kb的DNA片段的克隆确定为最终阳性转化克隆。带有 pUN1301-0sKinesin-13A过量表达载体的阳性农杆菌EHA105通过遗传转化法转化sar突变 体水稻，获得独立的、0sKinesin-13A基因过量表达的转基因sar突变体植株(TO代)；同时 用带有pUN1301空载体的农杆菌EHA105菌株转化sar突变体水稻，获得转化空载体对照的 转基因sar突变体植株(T0代)。分别从转基因sar突变体TO代植株及转空载体对照TO代植株上收获的种子， 然后将种子置于添加了潮霉素(25mg/L)的MS培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉 素抗性的阳性转化的Tl代小苗，将Tl代小苗移植到大田中生长发育至成熟。对Tl代 0sKinesin-13A过量表达的转基因sar突变体植株和转化空载体对照植株进行表型观察， 结果显示，所有的0sKinesin-13A过量表达的转基因sar突变体植株的籽粒和株高均恢复 到野生型表型，结果如图2中C和图1中C所示；而所有转化空载体对照植株的籽粒和株高 与突变体一致，结果如图2中D和图1中D所示。这些结果说明在sar突变体中过量表达 0sKinesin-13A基因，能将sar突变体的籽粒形状和植株高度恢复成野生型的正常表型，证 实在sar突变体中，确实是0sKinesin-13A基因的突变导致了籽粒形状改变和植株矮化的 表型。上述所用的双元载体pUN1301由pCAMBIA1301双元载体改造而成(Zhen Wang等， 2004，Plant Molecular Biology R印orter，22 :409_417 ；陈惠、赵原和种康，2008，植物学 通报，25 322-331)。pCAMBIA1301双元载体具有烟草花叶病毒35S启动子驱动的潮霉素磷 酸转移酶基因(图3的Hygromycin R)、卡那霉素抗性基因(图3的Kanamycin R)、限制 性内切酶克隆位点等功能序列；卡那霉素抗性基因在细菌中表达，用于细菌转化后筛选质 粒成功转化的阳性克隆；潮霉素磷酸转移酶基因在植物中表达，用于植物转化后筛选成功 完成外源基因插入的抗性植株。PUN1301双元载体是在pCAMBIA1301载体的限制性内切酶 克隆位点内的Hind III和BamH I酶切位点之间插入了玉米泛素蛋白基因Ubi-I启动子 (图3的Ubiquitin Promoter) ；Sac I和EcoR I酶切位点之间插入了胭脂氨酸合酶基因的终止信号序列(图3左下侧的Nos)；并且在二者之间引入BamH I, Sma I、Kpn I和Sac I四个酶切位点用于外源基因的插入；这样外源基因插入植物基因组后，就可以在玉米泛 素蛋白基因启动子的驱动下表达。玉米泛素蛋白基因启动子来源于玉米，在单子叶植物各 个器官组织中组成性表达，基因表达水平远高于烟草花叶病毒35S启动子，非常适合于外 源基因在单子叶植物中的过量表达(Christensen等，1992，Plant Molecular Biology, 18 675-689)。上述水稻遗传转化方法具体实施步骤如下所述 (1)水稻种子成熟胚愈伤组织的诱导和继代饱满的水稻成熟种子剥去颖壳；先用70%乙醇表面消毒lmin，再用0. 1 % HgCl2消 毒30min;用无菌水漂洗5次后，接种平铺到诱导培养基(表1)上；22 28°C的培养箱内， 24小时黑暗条件下培养2 3周后即有愈伤组织诱导形成；诱导出来的愈伤组织可从母体 上切离，转移到继代培养基(表1)上培养，2 3周后，愈伤组织长大，挑选浅黄色、质地较 致密的胚性愈伤组织用于转化，或者转移至新的继代培养基上继续培养。(2)农杆菌浸染液的制备挑取已PCR鉴定的、带有目标载体的农杆菌EHA105单菌落接种到含有利福平 (25yg/mL)和卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液体培养基中，28°C振荡培养至饱和期。然后将 培养至饱和期的农杆菌菌液稀释100倍接种到含卡那霉素和利福平的新鲜LB培养基中， 28°C振荡培养至对数期。在常温下6000rpm离心5min沉淀农杆菌，重悬沉淀于等体积的愈 伤转化AAM培养基(表1)中，在三角瓶中振荡培养20min得到农杆菌浸染液。(3)浸染及共培养选择生长状态良好的、1 3mm的黄白色致密愈伤组织转移到预培养基(表1)上 培养，置于22 28°C的培养箱内暗培养3 4天。转移预培养基上的愈伤组织到干净的灭 菌三角瓶中，倒入制备好的农杆菌浸染液，使愈伤组织完全浸泡在浸染液中，50 IOOrpm 摇动培养30min。取出愈伤组织，用无菌的滤纸吸去愈伤组织表面的浸染液。将浸染后的愈 伤组织转移至共培养培养基(表1)上，19 25°C暗培养三天。(4)选择培养及继代选择培养共培养后的愈伤组织先用无菌水漂洗5次以除去表面吸附的农杆菌；接着用洗菌 液(含35g/L蔗糖，10g/L甘露醇，300mg/L头孢霉素的无菌水，pH 5.8)浸泡30min ；然后再 用无菌水洗涤3次。愈伤组织用无菌滤纸吸干表面水份后转移到Sl筛选培养基(表1)， 放置到28°C的培养箱内暗培养；2 3周后，将愈伤组织直接转移到S2筛选培养基(表1) 上，扔弃那些完全发黑的愈伤组织；3 4周后，用镊子从褐色的老愈伤组织块上夹下新长 出的白色愈伤组织小块，放置到S3筛选培养基(表1)上培养。(5)转基因水稻的再生当S3筛选培养基上的抗性愈伤组织长至直径为5 12mm时转移到分化培养基 (附表1)上。先暗培养7 10天，再置光下培养1 2周。对于分化出来的较为弱小的 绿苗可在壮苗培养基(表1)上培养一段时间使之生长更为强壮，23°C 28°C，12 14小 时光照培养。当再生的小苗长至2 3cm高时，转移至生根培养基(表1)。待根系生长良 好，小苗长至8 IOcm时，打开盖炼苗6 15天。取出组织培养苗转移到土壤中，放到无 阳光直射的温室中适应培养，成活后可以移栽到大田种植，获得转基因水稻植株。
表1水稻组织培养和转化主要培养基及成分 表2AA盐和氨基酸的成分
9 表3MS维生素的组成 实施例3、通过RNA干扰技术降低0sKineSin-13A基因表达水平，培育籽粒为圆形、 植株矮化的水稻品种RNA干扰(RNAi)是真核生物体内由双链RNA介导的降解同源RNA的现象。RNAi 技术是将特异性的双链RNA导入生物体内，诱导RNA干扰机制的启动，从而达到降低甚至完 全抑制目标基因表达水平的目的。由于RNAi技术操作简易、基因表达抑制的效果明显且特 异性高，因此，RNAi技术被广泛应用于基因功能的理论研究和农作物的基因工程改良。本实施例中，为确保RNA干扰的特异性，选择了 0sKineSin-13A基因序列上一段 609bp (第1587-2195位碱基)的特异性DNA片段用于RNAi载体的构建，该序列与目前水稻基因组数据库(NCBI和TIGR)中其他序列没有相似性。根据这段特异性序列设计引物对，引物 3 :5，-GGGGTACCACTAGTTGACAGGGTTAAAAGTCTC-3，禾口引物 4 5 ’ -GGGGATCCGAGCTCATTTCCACATCATCACAAG-3 ’，进行RT-PCR扩增合成0sKinesin_13A基因的RNAi片段(637bp)，扩增步骤与实施 例2中0sKinesin-13A基因全长cDNA产物的扩增步骤一致。扩增产物先后以正、反两个方向插入到RNAi双元载体pTCK303(Wang等，2004， Plant Molecular Biology Reporter, 22 409-417)中，构建 p0sKinesin_13A-RNAi 载体。 具体步骤如下扩增产物首先经Spe I和Sac I双酶切，连接到RNAi双元工具载体pTCK303 中，构建“pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列”连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5 a 菌株，生长出来的大肠杆菌单菌落用上述引物3和引物4进行PCR验证，挑选出能扩增得到 637bp DNA片段的克隆。PCR验证的克隆再接种培养，提取质粒，用Spe I和SacI双酶切验 证，能切出约615bp片段的克隆确定为“pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列”阳性克隆。接 着，将“pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列”阳性克隆提取的质粒以及扩增合成的637bp的 0sKinesin-13A基因RNAi片段再用Kpn I和BamH I进行双酶切，酶切后将二者连接构建 "pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列-内含子-反向序列”(简称p0sKinesin_13A-RNAi)连 接产物。pOsKinesin-UA-RNAi连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株并提取质粒，分别用Spe I单酶切、Sac I单酶切、Hind III和BamH I双酶切、以及Hind III和Kpn I双酶切进行酶 切验证。由于插入的0sKinesin_13A反向片段内部也含有Sac I和Spe I酶切位点，因此Spe I单酶切可切下约500bp的水稻内含子片段，Sac I单酶切可切下0sKinesin-13A-正向序 列_内含子_反向序列片段，共约1. 7kb。HindIII和BamH I双酶切可切出约2kb的玉米泛素 启动子片段；Hindlll和Kpn I双酶切可切出约2. 6kb的泛素启动子-0sKinesin-13A-反向 序列片段。酶切验证显示的酶切图谱与上述预期完全一致，证实0sKinesin-13A基因RNAi 片段的正向及反向序列均已正确插入到PTCK303质粒中，得到了 p0sKinesin-13A-RNAi阳 性质粒。经PCR和酶切验证的大肠杆菌阳性克隆最终还进行了测序验证，证实正、反两个 0sKinesin-13A-RNAi序列都已经插入到pTCK303载体中，且插入方向和核苷酸序列都正 确。构建好且测序验证正确的p0SKineSin-13A-RNAi质粒(图4)通过冻融法转化到 农杆菌菌株 EHA105 (Hood 等，1993，Transgenic Research, 2 208-218)中，涂布到含有利福 平(25 u g/mL)和卡那霉素(50 u g/mL)的LB固体培养基上筛选阳性转化克隆，生长出来的 农杆菌单克隆用以下两个引物对分别进行PCR验证。在PTCK303载体Kpn I酶切位点内侧 的内含子上，用引物 5 :5，-ATGCTCTAACCTTGAGTACCTATC-3，禾口引物 4 5 ’ -GGGGATCCGAGCTCATTTCCACATCATCACAAG-3 ’进行PCR可扩增得到约650bp的0sKinesin-13A-反向序列片段；在pTCK303载体 Spe I酶切位点内侧的内含子上，用引物 3 :5，-GGGGTACCACTAGTTGACAGGGTTAAAAGTCTC-3，禾口引物 6 5，-TTCTCTTGAATCTGGTTGGCAA-3，进行PCR可扩增得到约600bp的0sKineSin-13A-正向序列片段。能同时扩增得 到正向和反向序列的克隆确定为最终阳性转化克隆。
经PCR鉴定验证为阳性的转化克隆用实施例2所述的水稻遗传转化法转化野生 型水稻愈伤组织，经潮霉素筛选及分化后获得7个独立的、0sKinesin-13A基因RNA干扰抑 制表达的转基因野生型植株株系(TO代)。同时用带有PTCK303空载体的农杆菌EHA105 菌株转化野生型水稻，获得RNA干扰对照植株(TO代)。为了确定转基因株系中内源 0sKinesin-13A基因的表达是否受到抑制，我们通过半定量RT-PCR的方法对转基因株系和 野生型水稻中0sKinesin-13A的表达量进行了检测。分别提取7个独立的TO代转基因株 系和野生型水稻成熟叶片的总RNA，用引物1和2进行RT-PCR扩增。结果显示，所有7个株 系中内源0sKinesin-13A表达量与野生型相比均出现了显著降低(图7)，说明RNA干扰机 制在转基因株系中发挥作用，抑制了 0sKinesin-13A基因的表达。分别从RNA干扰抑制表达转基因TO代植株及RNA干扰对照TO代植株上收获种 子，然后将种子置于添加了潮霉素(25mg/L)的MS培养基上进行筛选培养，获得具有潮 霉素抗性的阳性转化Tl代小苗，将Tl代小苗移植到大田中生长发育至成熟。对Tl代 的0sKinesin-13A-RNAi转基因植株和RNA干扰对照植株进行表型观察，结果显示，所有 0sKinesin-13A-RNAi转基因植株的籽粒长度变短、呈现为圆形(图2中F)，植株高度变矮 (图1中E)，而所有RNA干扰对照植株的植株籽粒和株高与野生型表型一致(图1中F)。 这些结果说明通过本实施例所述的方法，可以降低水稻0sKinesin-13A基因的表达水平， 达到改变水稻籽粒形状和植株高度的目的，培育籽粒长度变短、植株矮化的水稻品种。本实施例中所用的RNAi双元工具载体PTCK303是在过量表达双元工具载体 PUN1301的基础上构建的，S卩，在pUN1301载体的KpnI和Sac I酶切位点之间插入了 "KpnI-Xho I-Sal I-Bgl II-NheI_478bp 的水稻内含子-Cla I-Spe I-Xba I-Sac I“DNA 片段(Wang 等，2004，Plant Molecular Biology R印orter，22 :409_417 ；专利申请号 03160092. 1)。因此，RNAi工具载体pTCK303包含了玉米泛素蛋白启动子和水稻的内含子， 内含子两侧具有丰富的酶切位点，只需将目标基因的正反两个序列分别插入水稻内含子两 侧就可以完成RNAi载体的构建；转化水稻后，插入基因组的“正向序列-内含子-反向序 列”片段将被转录成外源RNA ；这种具回文序列的RNA会形成带发夹结构的双链RNA，然后 双链RNA被降解成21 23nt的小RNA片段，驱动RNA干扰机制的运行，导致目标基因转录 和转译产物水平的降低或消失。实施例4 :0sKinesin-13A基因在水稻中的表达模式分析本发明利用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法对0sKinesin_13A基因在水稻中 的表达模式进行了分析。RT-PCR分析的具体实施步骤为用Trizol试剂提取野生型水稻不同组织的总 RNA,包括7天龄水稻幼苗的根、4mm长的幼芽、成熟叶(叶片和叶鞘的混合物)、拔节后的 茎、授粉前的成熟颖花、授粉后发育6天的籽粒及成熟胚诱导的愈伤组织；以总RNA为模板， 反转录获得第一链cDNA ；再以第一链cDNA为模板，用0sKinesin-13A基因特异性的引物 对引物 7 5，-TCTACTACTCAGTATGGTGGCTCCC-3，禾口引物 8 5，-TTCTCTTGAATCTGGTTGGCAA-3，进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在检测的不同组织 中，0sKinesin-13A基因均有较高水平的表达，且表达量的差异并不明显(图5中A)。
同时，应用实时荧光定量RT-PCR技术对0sKineSin-13A基因在水稻各个组织中 的相对表达量进行定量分析，具体实施步骤为以上述来源于不同组织的第一链cDNA为模 板，用0sKinesin-13A基因特异性的引物对引物 9 5，-TGGTCAAACAGGTAGTGGC-3，禾口引物 10 5，-GGTAGACAGGCTGATGCAA-3，进行了实时荧光定量PCR扩增；扩增结果按2_AACT方法进行了相对定量分析。结 果显示0sKinesin-13A基因在检测的7种组织中表达量非常接近，其中籽粒中表达量最低， 幼芽中表达量最高并约为籽粒中表达量的2. 5倍，其余组织中的表达量约为籽粒中表达量 的1 2倍(图5中B)。0sKinesin-13A基因这种组成性的、广泛的表达模式说明该基因 在水稻的各个生长发育过程中都可能具有一定的功能，是控制水稻株高和粒形的重要基因 之一。
权利要求
一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻粒形和株高相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)_3) 中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2；2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系和重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，是通过抑制权利要求2或3所述编码基因的表达水平， 得到转基因植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述转基因植物为下述1)、2)或3)的植物1)与目的植物相比，籽粒变为圆形且植株矮化；2)与目的植物相比，籽粒变为圆形；3)与目的植物相比，植株矮化。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述抑制权利要求2或3所述的编 码基因的表达水平是通过RNA干扰实现的。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于所述RNA干扰是通过将双链RNA的编码 DNA导入目的植物中实现的；其中，所述双链RNA的一条链的核苷酸序列是将序列2的第 1587-2195位碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述双链RNA的编码DNA的是如下双链 DNA片段SEQ正向-X-SEQ反向；其中，的核苷酸序列是序列2的第1587-2195位碱基序列；与所述向互补； X是3￡0_与SEQ_之间的间隔序列，X与所述均不互补。
10.根据权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或 单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。全文摘要
本发明公开了与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻粒形和株高相关的由1)衍生的蛋白质。本发明中与水稻粒形和株高相关的蛋白主要控制水稻粒形和株高，通过RNA干扰降低所述蛋白编码基因的表达水平，可得到籽粒变为圆形、植株矮化的水稻。因此利用该基因可以培育籽粒为圆形、植株矮化的新型水稻品种，对提高和稳定水稻产量、提升稻米外观品质具有重要的意义。
文档编号C12N1/19GK101870727SQ20101022742
公开日2010年10月27日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者严长杰, 李唐, 王台, 邓祝云 申请人:中国科学院植物研究所