一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽及其应用。该短肽的短肽片段、类似物、衍生物、变体的氨基酸主序列具有与该短肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有抗菌止痒消炎消肿的各类皮肤消毒或治疗皮肤病的药物，制备神经性皮炎、接触性皮炎、慢性湿疹、虫咬性皮炎及瘙痒性皮肤病的局部治疗的药物应用。本发明涉及的短肽分子结构明确，生产技术成熟，成品无毒无害无副作用，显著特点是治愈后不落疤痕，是一种优异的外用皮肤消炎消肿止痒消毒剂或皮肤病药物。
【专利说明】一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术医药领域，本发明更具体涉及了一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽及其应用。
【背景技术】[0002]各类皮肤红肿、发炎、瘙痒是常见多发性的皮肤病，严重影响人们的健康，通常分为神经性皮炎、接触性皮炎、急慢性湿疹、虫咬性皮炎及瘙痒性皮肤病等。目前市场上有各种膏体药物治疗皮肤病，但这些膏类药物有的疗效不佳有的有副作用而不能治愈皮肤病，有的虽然能够治愈皮肤病，但却会让患者落下疤痕，主要原因是这些药物大都是无机化合物，化学合成所得的产品。而用生物活性肽——来自于蛋白质的片段的氨基酸序列所形成的短肽，做为皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕的药物，迄今尚未见文献报道。因此，研制抗菌止痒消炎消肿去疤痕的生物活性短肽及其应用具有十分重要的意义与价值。
【发明内容】
[0003]本发明目的是针对上述问题，提供一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽及其应用。
[0004]本发明所述的一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽，其特征在于:
<1>组成短肽的氨基酸序列如下所示:
Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys或者
Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg 或者 Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg
<2>所述短肽的核苷酸序列是指短肽的每个氨基酸序列所对应的3个密码子构成的基因序列。
[0005]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其特征在于:短肽片段的氨基酸序列具有与所述短肽氨基酸序列> 70%的相同性，或> 90%的相似性，所述片段为把所述的6个或7个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个或6个氨基酸组成的与所述短肽具有同样生物活性的短肽。
[0006]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其短肽氨基酸序列所对应的核苷酸的制备方法及其应用，其特征在于:短肽的核苷酸片段的碱基序列具有与所述短肽的碱基序列> 70%的相同性，^ 90%的相似性，所述片段为把所述的6个或7个氨基酸的对应的核苷酸序列从任意位置截取成3个或4个或5个或6个氨基酸对应的碱基序列所组成的与所述短肽的核苷酸序列具有同样生物活性的短肽。
[0007]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其短肽类似物，其特征在于:所述短肽类似物具有与所述短肽相同的生物活性，所述类似物是指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。[0008]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其短肽衍生物，其特征在于:所述短肽衍生物的氨基酸序列具有与所述短肽氨基酸序列> 70%的相同性，^ 90%的相似性，所述衍生物是指把所述短肽的氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述短肽具有同样生物活性的短肽。
[0009]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其短肽变体，其特征在于:所述短肽变体的氨基酸序列具有与所述短肽氨基酸序列> 70%的相同性，^ 90%的相似性，所述变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
[0010]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其特征在于:所述的短肽采用化学合成方法制备。
[0011]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其特征在于:所述核苷酸采用人工合成方法制备。
[0012]本发明所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的制备方法及其应用，其特征在于:所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有抗菌止痒消炎消肿的各类皮肤消毒或治疗皮肤病的药物。其对皮肤病恢复过程中，对皮肤细胞具有修复作用，从而使得皮肤不留疤痕，其适用于神经性皮炎、接触性皮炎、急慢性湿疹、虫咬性皮炎及瘙痒性皮肤病的局部治疗。
[0013]本发明的显著优点是:本发明的短肽来自于运用生物信息学的方法把国际蛋白质数据库的蛋白进行序列比对，筛选出来的一种新型的具有活性功能的生物活性肽，运用本发明的短肽对皮肤病的治疗拥有卓越的显著功效，最大的优点是治愈后皮肤不留疤痕。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明涉及的短肽杀菌效果实验图。其中(a)实验组24小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌；(c)实验组48小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(d)对照组在48小时后长出的金黄色葡萄球菌的数量增多，颗粒明显变大。
[0015] 图2是患者被蚊子叮咬后，使用本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽喷剂，使用前后对比效果图。其中(a)临床患者的胳膊，被蚊子叮后，出现红肿与瘙痒；(b)喷涂本发明的短肽喷剂，患者立刻感到不痒了 ；(C)喷涂本发明的短肽喷剂10分钟后，红肿完全消失，痊愈。
[0016]图3是本发明涉及的短肽杀菌效果实验图。其中(a)实验组24小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌；(c)实验组48小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(d)对照组在48小时后长出的金黄色葡萄球菌的数量增多，颗粒明显变大。
[0017]图4是本发明涉及的短肽衍生物杀菌效果实验图。其中(a)实验组24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌；
图5是本发明涉及的短肽杀菌效果实验图。其中(a)实验组48小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(b)对照组在48小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0018]图6是本发明涉及的短肽截取的短肽片段杀菌效果实验图。其中(a)实验组48小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在48小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0019]图7是本发明涉及的短肽变体杀菌效果实验图。其中(a)实验组24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0020]图8是本发明涉及的短肽融合蛋白质SOD所制得的融合蛋白杀菌效果实验图。其中(a)实验组24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌。
【具体实施方式】
[0021]短肽的制备方法采用化学合成的方法，即本领域熟知的已经非常成熟的固相肽合成方法，既可以采用Boc方法也可以采用Fmoc方法。具体做法就是将被保护的氨基酸逐个偶联到惰性固相载体上去，然后利用强酸将肽链从载体上裂解下来，同时去除侧链保护。
[0022]短妝的氨基酸序列，Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys或者 Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg或者Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg为主要序列，从任意位置截取成3个或4个或5个或6个氨基酸组成的与所述短肽具有同样生物活性的短肽片段，短肽类似物，短肽衍生物，短肽变体等都具有本发明所述的功效作用。
[0023]核苷酸采用人工合成方法制备；编码短肽的核苷酸包含下组中的一种:
Ca)编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸； (b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(C)与(a)或(b)中所述核苷酸有> 75%相同性的核苷酸；
该核苷酸基本由编码具有〈1>所述的氨基酸序列短肽的核苷酸组成，本发明的核苷酸序列，其形式为DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的也可以是双链的。编码短肽的编码区序列可以和〈2>中的核苷酸相同，也可以不同，称为变异体，其中变异体是指具有编码权利要求1中的氨基酸序列的编码，但可以和〈2>中的核苷酸不同。变异体可以是一个或几个核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不会改变编码〈1>中氨基酸序列的短肽的活性功能。
[0024]该短肽或核苷酸的“变体”是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列。改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入、添加或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，也可以有“非保守性”改变，其中替换的氨基酸不具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或几个氨基酸或核苷酸的缺失；“插入”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中间任意位置插入一个或几个氨基酸；“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸；“替换”是指用不同的氨基酸或核苷酸替换一个或几个氨基酸或核苷酸。
[0025]该短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备抗菌止痒消炎消肿包括但不限于下述疾病的药物的用途:1.神经性皮炎:慢性单纯性苔藓，包括局限性神经性皮炎和弥漫性神经性皮炎。
[0026]2.接触性皮炎:包括变态反应性接触性皮炎和刺激性接触性皮炎以及速发型接触性反应、光毒性及光变态反应性接触性皮炎等。
[0027]3.急慢性湿疹:包括急性湿疹、亚急性湿疹和慢性湿疹。
[0028]4.虫咬性皮炎:包括蚊虫叮咬后引起的皮炎。
[0029]5.瘙痒性皮肤病:包括普通型和过敏性皮肤瘙痒症。
[0030]6.外阴瘙痒症:包括肛门、阴唇和阴囊瘙痒症。
[0031]在计算短肽片段、短肽衍生物和短肽变体的氨基酸主序列具有与短肽氨基酸主序列的相同性和相似性时，“相同性百分率”是指两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同的百分率。根据 Cluster 法(Higging D.G.& Sharp P.M., Gene 1988，73:234-237 )通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算:
__mi A鼙序到B之_匹配讓幾.纂个数父100%
序到A鐘幾.基个数-序列A中间__蔑?个数-序列B宇變*个.“相似性”是指在确定两条氨基酸序列比对中相同氨基酸序列位置确定后，在相同氨基酸之间排列的对应的氨基酸的保守性取代程度。根据生物信息【技术领域】周知的氨基酸得分 PAM 250 scoring matrix (Dayhoff, M.Schwartz, R.M.and Orcutt, B.C.Atlasof Protein Structure 1978， 345-352 ； DeLisij C.and Kanehisaj M.MathematicalBiosciences 1984.69: 77-85 ；Schwartz, R.M.and Dayhoffj M.0.Atlas of ProteinStructure, 1979.353-358)，当相对应的不同氨基酸比较得分> O时，该两个氨基酸相似；当不同氨基酸得分< O时，两个氨基酸不相似。两个氨基酸序列如序列C和序列D之间的相似性百分率通过下式计算:
(序列C与If列1>之_區配的殘基个ft+ff列C与序列6之__似_.基个数)X 100?mi c Μ*基个数-序列c中间11的鳗基个歡-序到1.中___獲基个数其中，序列C中间隔的残基个数和序列D中间隔的残基个数都不包括相似氨基酸的个数。
[0032]下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列所有列举实施例所涉及的所有合成短肽都具有本发明涉及的药物功能而不限于所列举功能。
[0033]实施例1
抗菌实验效果(合成本发明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，经过HPLC纯化后，纯度超过97%，采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的短肽制成浓度为0.1 mg/ml的液体，取100ml，加入到固体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl2.5g和琼脂7.5g)存在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入SOul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图1所示)，其中(a)实验组24小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌；(c)实验组48小时培养的结果,无金黄色葡萄球菌长出来；(d)对照组在48小时后长出的金黄色葡萄球菌的数量增多，颗粒明显变大。
[0034]实施例2
神经性皮炎(合成本发明涉及的短肽:Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，经过HPLC纯化后，纯度超过97%，采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的短肽制成浓度为0.1 mg/ml的液体，取100ml，加入到固体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl
2.5g和琼脂7.5g)存在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入SOul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图3所示)，其中(a)实验组24小时培养的结果,无金黄色葡萄球菌长出来；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌；(c)实验组48小时培养的结果,无金黄色葡萄球菌长出来；(d)对照组在48小时后长出的金黄色葡萄球菌的数量增多，颗粒明显变大。
[0035]临床病例1，福州市鼓楼区蒋女士，年龄36岁，脖子颈部出扁平丘疹，剧痒难耐，抓挠皮破，医生诊断为神经性皮炎，使用医生所开药膏，无显著疗效，服用消炎药，也无明显效果，依旧奇痒无比。改用本 发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽制备成的喷剂，涂上后，痒立刻消失，红肿渐渐消失，3天后痊愈。
[0036]实施例3
接触性皮炎(合成本发明涉及的短肽衍生物，在酪氨酸加磷酸类基团修饰:T yr/7 -Leu-Tyr-G I u_Va 1-AI a-Arg )
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，在酪氨酸Tyr的R基团用磷酸基团取代，经过HPLC纯化后，纯度超过98%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成10ug/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0037]采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的短肽衍生物制成浓度为0.1 mg/ml的液体，取100ml，加入到固体培养基存(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和琼脂7.5g)在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入80ul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图4所示)，其中(a)实验组24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌长的数量明显少于对照组；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0038]临床病例2，福州市台江区温先生，年龄25岁，系裤腰带接触皮肤导致腰部皮肤红肿、泡状、触痒，使用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽制备成的喷剂，涂上后，接触即不痒了，2小时后红肿消失，泡紧缩，破皮处结硬壳，3天痊愈，未留下任何疤痕。
[0039]实施例4
急慢性湿疫(合成本发明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，经过HPLC纯化后，纯度超过99%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成100 ug/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0040]临床病例3，福州市鼓楼区林小姐，年龄25岁，不明原因脚面红肿、泡状、奇痒难耐，医生诊断为丘疹皮炎，使用医生所开药膏，无显著疗效，口服消炎药物，也无显著效果，半个月有余，无法忍受奇痒，后改用应用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽制备成的喷剂，喷涂后，立即止痒，3天痊愈。
[0041]实施例5
虫咬性皮炎(合成本发明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，经过HPLC纯化后，纯度超过98.5%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0042]采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的短肽制成浓度为0.1 mg/ml的液体,取100ml,加入到固体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和琼脂7.5g)存在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入80ul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图5所示)，其中(a)实验组48小时培养的结果，无金黄色葡萄球菌长出来；(b)对照组在48小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0043]临床病例4，福州市鼓楼区陶小姐，年龄27岁，夜晚睡觉被螨虫叮咬， 浑身腿部遍布红斑，奇痒，把应用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽，喷剂喷涂腿部后，立即止痒，I天内红斑消失，痊愈。
[0044]实施例6
虫咬性皮炎(合成本发明涉及的短肽片段，在序列中截取4个或者5个氨基酸:Leu-Tyr-Glu-Val 或 Tyr-Glu-Val-Ala-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽Leu-Tyr-Glu-Val和Tyr-Glu-Val-Ala-Arg,经过HPLC纯化后，纯度超过97.8%,96.3%，用超纯水分别溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0045]采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的短肽片段制成浓度为0.1 mg/ml的液体，取100ml，加入到固体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏
2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和琼脂7.5g)存在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入80ul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图6所示)，其中(a)实验组48小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在48小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0046]临床病例5，福州市台江区傅小姐，年龄22岁，大学生，在宿舍，蚊子多，腿部被蚊子叮咬的都是红色的包，早晨起床后，发现遍布小腿的红肿的包，立刻喷涂把应用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽后，立即止痒，10分钟内部分红肿的包消失，一个小时内，皮肤恢复常态，看不出任何被蚊子叮咬过的痕迹，没有明显疤痕出现。
[0047]实施例7
虫咬性皮炎(合成本发明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，经过HPLC纯化后，纯度超过99.1%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0048]临床病例6，福州市鼓楼区李女士，年龄51岁，是过敏性皮肤，被蚊子叮咬后，皮肤经常红肿，并且红肿面积经常越来越大，痒也越来越严重，经常要3、4天才会好，且经常留有痕迹。她在被蚊子叮咬后，立刻喷涂把应用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽后，立即止痒，10分钟内红肿消失，半小时内，皮肤恢复常态，看不出任何被蚊子叮咬过的痕迹。如附图2所示:其中(a)临床患者的李女士的胳膊，被蚊子叮后，出现红肿与瘙痒；(b)在被叮咬部位喷涂本发明的短肽喷剂，患者立刻感到不痒了 ；(c)喷涂本发明的短肽喷剂10分钟后，红肿完全消失，痊愈。
[0049]实施例8
瘙痒性皮肤病(合成本发明涉及的短肽变体，即在序列的N端增加一个Gla氨基酸:Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽变体，即在N端增加一个Gla氨基酸，合成短肽序列变体序列Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg,经过HPLC纯化后，纯度超过99.1%,用超纯水溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液,装入喷剂瓶。
[0050]采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽变体，即在短肽中间插入一个Tyr氨基酸，合成短肽序列变体序列Tyr-Leu-Tyr-Glu-Tyr-Val-1le-Arg,经过HPLC纯化后,纯度超过98.6%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0051]采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽变体，即在短肽中间把Glu替换成一个Tyr氨基酸,合成短肽序列变体序列Tyr-Leu-Tyr-Tyr-Val-Ala-Arg,经过HPLC纯化后,纯度超过97.6%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液，装入喷剂瓶 。[0052]采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的短肽变体Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie-Arg制成浓度为 0.1 mg/ml 的液体,取 100ml,加入到固体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和琼脂7.5g)存在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入80ul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图7所示)，其中(a)实验组24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0053]同样的，对短妝变体 Gla-Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie_Arg、Tyr-Leu-Tyr-Glu-Tyr-Val-1le-Arg和Tyr-Leu-Tyr-Tyr-Val-Ala-Arg也做了相应抗菌实验,实验结果与本实施例中的短肽变体Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg的实验结果无明显差别，故在此不作复述。
[0054]临床病例7，沈阳市沈河区李先生，皮肤干燥，奇痒难耐，分别在身体不同部位喷涂应用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽喷剂后，立即止痒，效果非常明显。
[0055]实施例9
外阴瘙痒症性皮肤病(合成本发明涉及的短肽=Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg)
采用固相Fmoc方法化学合成本发明短肽，经过HPLC纯化后，纯度超过97.1%，用超纯水溶解本发明的肽，制备成I mg/ml的溶液，装入喷剂瓶。
[0056]临床病例8，福州市鼓楼区李先生，年龄51岁，外阴部瘙痒，喷涂本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽制备成的喷剂，立即止痒，当天痊愈。
[0057]实施例10 外阴瘙痒症性皮肤病
采用本发明涉及的短肽Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg的核苷酸序列,应用基因重组技术融合蛋白质SOD (人超氧化物歧化酶)，纯化后所得融合蛋白。
[0058]采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37°C培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量与IOOml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床(37°C，150r/min)培养12h，后可看到培养液由澄清变成浑浊。将本发明涉及的融合蛋白制成浓度为0.1 mg/ml的液体,取100ml,加入到固体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏
2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和琼脂7.5g)存在的培养皿中，涂均匀，同时，不加短肽的空白作为对照；最后再加入80ul的已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37°C恒温培养箱中培养，并分别与24h和48h后观察记录菌体生长情况。实验结果表明，从培养24h和48h后的结果观察到，本发明涉及的短肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用(附图8所示)，其中(a)实验组24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌的数量明显少于对照组；(b)对照组在24小时后长出金黄色葡萄球菌。
[0059]临床病例9，福州市鼓楼区王女士，年龄31岁，外阴部瘙痒，喷涂应用上述方法制备的本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿去疤痕短肽喷剂后，立即止痒，当天痊愈。
[0060]SEQUENCE LISTING 〈110〉李昊
〈120〉一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽及其应用
〈160〉 3
〈210〉 I
〈211〉 6
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 I
Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
I5
〈210〉 2
〈211〉 7
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 2
Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg
I5
〈210〉 3
〈211〉 7
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 3
Tyr Leu Tyr Glu Val He Arg
15
〈210〉 4
〈211〉 4
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 4
Leu Tyr Glu Val
1
【权利要求】
1.一种抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽，其特征在于:组成短肽的氨基酸序列如下所示: Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys或者 Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg 或者
Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg 。
2.一种编码根据权利要求1所述短肽的核苷酸。
3.—种如权利要求1所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的短肽片段，其特征在于:所述短肽片段为将所述的6个或7个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个或6个氨基酸组成的，且具有抗菌止痒消炎消肿去疤痕活性的短肽片段。
4.一种如权利要求2所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的短肽片段，其特征在于:所述短肽片段的核苷酸片段为把所述的6个或7个氨基酸的对应的核苷酸序列从任意位置截取成3个或4个或5个或6个氨基酸对应的碱基序列所组成的，且具有抗菌止痒消炎消肿去疤痕活性的短肽片段。
5.一种如权利要求1所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的类似物，其特征在于:所述短肽类似物是指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成，且具有抗菌止痒消炎消肿去疤痕活性的多肽序列或蛋白质。
6.一种如权利要求1所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的衍生物，其特征在于:所述短肽衍生物是指把所述短肽的氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后，且具有抗菌止痒消炎消肿去疤痕活性的短肽。
7.—种如权利要求1所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的变体，其特征在于:所述短肽变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
8.—种如权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的抗菌止痒消炎消肿去疤痕的短肽的应用，其特征在于:所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体制备具有抗菌止痒消炎消肿的皮肤消毒或治疗皮肤病的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的皮肤病为神经性皮炎、接触性皮炎、慢性湿疹、虫咬性皮炎、瘙痒性皮肤病或外阴瘙痒症。
【文档编号】C12N15/11GK103467569SQ201310346091
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月10日 优先权日:2013年8月10日
【发明者】李 昊 申请人:李 昊