专利名称：基因OsBBX22b在延迟水稻开花期方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及基因0sBBX22b在延迟水稻开花期方面的应用。
背景技术：
开花期(从种子萌发到始穗的时间，days to flowering)是水稻及禾谷类农作物的重要农艺性状之一，开花期长短直接反映了水稻品种生育期长短，适宜的生育期在维持水稻高产稳产中扮演着关键角色(Tsuji et al.，Rice，2008，1:25-35 ;胡时开等，中国水稻科学，2012，26(3) :373-382)。一直以来，水稻开花期调控机制是分子生物学家和育种家关注和研究的热点。开花期由许多基因控制，而这些基因的表达水平与环境因子如日照长度和温度密切相关。
光周期调控的开花期是一个复杂的系统过程。叶片测定光周期产生可移动的开花信号(称为成花素，florigen)，该信号从叶片移至茎顶端，然后茎顶端分生组织感受信号启动花芽形成。水稻是典型的短日植物，短日(SD)条件诱导Hd3a (Heading date3a)的表达。 在SD条件下，Hd3a在叶片韧皮组织中表达上调，这些蛋白质转移至顶端分生组织，诱导花芽的启动，因此 Hd3a 被称为成花素(Tamaki et al. Science, 2007，316:1033-1036)。在植物中最保守的光周期调控开花途径是GI (gigantea) -CO (constans) -FT (glowering locus T)。在拟南芥中，该途径仅仅在长日(LD)条件下有活性，这是因为在LD条件下CO的表达在光期结束时表达提高，这样避免了暗条件下COPl对其降解作用，从而保证有充足的CO诱导 FT的表达，然而SD条件下，CO积累出现在暗期，CO蛋白质一旦产生会立即被降解。水稻中对应的光周期开花途径是OsGI-Hdl (Heading datel) _Hd3a，它们分别是拟南芥GI、CO和 FT的直系同源基因。OsGI是Hdl的激活子，其表达显示生物节律性，表达峰值出现在光期结束时。Hdl编码Β-box锋指蛋白，其C端含有CCT结构域(constans, constans-like, and timing of cab expression)。在SD条件下，hdl突变体中Hd3a的表达水平降低。Hdl在暗期中间表达水平最高，Hd3a在光期开始时表达水平最高。在SD条件下，Hd3a表达的另一个激活子是Ehdl (Early heading datel),它是一种B型响应调节子(B-type response regulator) (Doi et al. Genes Dev, 2004，18:926-936)。Ehdl 在拟南芥中无直系同源基因，它的表达受 0sMADS51 和 Ehd2/RIDl/0sIDl 的上调(Wu et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105:12915-12920; Itoh et al.，Nat Genet, 2010，42:635-638))。此外，OsGI 通过0sMADS51或者通过蓝光信号激活Ehdl在光期开始时大量表达(Kim et al.，Plant Physiol, 2007，145:1484-1494)。
然而，LD条件抑制Hd3a表达。在LD条件下，Hdl抑制Hd3a的表达，Hd3a的表达水平相当低，这样0sGI-Hdl-Hd3a形成了一个开花阻遏途径。光敏色素介导的信号是Hdl 从SD下的促进子转变成LD下的阻遏子的重要调节因子。LD下，Hdl阻遏子的功能还被 CK2 (casein kinase2)活性增强。此外，在LD下，Hd3a的表达也被Ehdl上调，而Ehdl被 Ghd7 (Grain number, plant height and heading date7)抑制。在 LD 下，Ghd7 的表达被特异性地上调，因此Ghd7通过抑制Ehdl-Hd3a途径而下调Hd3a表达，从而抑制开花(Xue et al. , Nat Genet, 2008，40 (6) : 761-767)。另外 E3 泛素连接酶 SPLll (Spotted IeaflI) 通过与其相互作用蛋白质SPIN相互作用而抑制Hd3a的表达。在长日条件下，0sMADS56、 LECl 和 FUSCA-LIKE1 (OsLFLl)能够消弱 Ehdl 的表达。
水稻是短日植物，但是在LD条件下，水稻最终也能开花。这可能是因为，尽管LD下 Hd3a的表达相当低，但是残余的Hd3a也能够最终诱导水稻开花。然而Hd3a RNAi转基因植株在SD条件下开花延迟，但在LD下对开花无影响。据此推测，除了 Hd3a，还有其他成花素控制开花。后来研究表明RFTl (rice flowering locusl)是另一个成花素(Komiya et al., Development, 2009, 135:3443-3450)0RFTlRNAi株系对SD下的花期无影响，但明显延迟长日照下的开花。可见水稻根据光周期不同利用两种成花素Hd3a和RFTl控制开花(Komiyaet al. , Development, 2008，135:767-774)。当Hd3a和RFTl的表达均被抑制时，水稻不能开花， 这表明水稻开花完全依赖于成花素活性。在长日条件，RFTl促进开花，其表达受0sMADS50 和Ehdl正调控，0sMADS50-Ehdl-RFTl这条途径也是LD下所特有的。Ghd7通过抑制Ehdl的表达而下调 RFTl 基因的表达(Osugi et al.，Plant Physiol, 2011，157 (3) : 1128-1137.)。 Hd3a或者RFTl作为成花素从叶片移至顶端分生组织，促进0sMADS14和0sMADS15基因的表达，从而启动生殖生长的开始(Komiya et al.，Development, 2009，135:3443-3450)。发明内容
本发明从水稻日本晴中分离克隆到B-box锌指蛋白的0sBBX22b基因(进化树分析表明，该蛋白质与拟南芥的BBX22属于同一个分支，该基因编码的氨基酸序列与拟南芥的 AtBBX22蛋白质同源性为68%，故命名为0sBBX22b)，该基因在水稻中过量表达后，转基因阳性植株的开花时间明显较非转基因植株延迟，在长日条件下延迟8-10天，在短日条件下延迟15天。因此，在水稻中过量表达0sBBX22b基因对于延迟水稻开花期具有重要意义，这为调控水稻及其它植物开花时间提供了新的基因资源和新思路。
本发明申请人在一个水稻光敏色素突变体中，利用基因表达图谱鉴定到一个序列号为AK106865的、编码B-box锌指蛋白的0sBBX22b基因的信使RNA序列。水稻0sBBX22b 基因信使RNA序列为2055个碱基，编码377个氨基酸和一个终止密码子。本发明是通过 PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的0sBBX22b基因的全长编码区，包含1134个碱基，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高0sBBX22b基因的表达，得到0sBBX22b基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，试验田条件下(5月_9月，山东济南，长日条件)，阳性转基因水稻植株的开花期较非转基因植株延迟了 8-10天，而在短日条件下(9小时光照，30° C± I ; 15小时黑暗，27° C±l)，转基因水稻的开花时间较非转基因水稻延迟了约15天。利用荧光定量分析结果表明，0sBBX22b 过量表达抑制了开花素编码基因Hd3a和RFTl的表达，从而延迟了水稻开花。
本发明用于构建过量表达0sBBX22b基因的植物表达载体、增强0sBBX22b基因表达的DNA序列如SEQ ID NO I所不，氣基酸序列如SEQ ID NO 2所不。
本发明利用水稻品种日本晴的0sBBX22b基因的cDNA片段作为应用基因，将该基因正向转入水稻中，提高0sBBX22b基因的表达水平，转基因水稻植株表现出开花期延迟。
本发明的优点在于
(I)本发明提供了一种延迟开花的水稻基因0sBBX22b的应用。申请人在水稻中过量表达0sBBX22b基因表达后，发现转基因阳性植株的开花期延迟。
(2)本发明首次分离克隆了水稻0sBBX22b基因，并首次在水稻中过量表达了 0sBBX22b基因。为改良过早成熟的水稻品种提供了新的思路，也为其它作物利用异源基因技术延迟开花期提供了理论支持。
(3)本发明首次揭示了水稻0sBBX22b基因延迟开花的机制，为水稻等禾谷类作物以及其它作物改良开花期的研究提供支持。
图I为本发明的0sBBX22b基因表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18_T载体上的0sBBX22b基因利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390_ubi植物表达载体上BamHI 和SpeI之间的DNA片段，这样0sBBX22b基因正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-BBX22b 植物表达载体。
图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中0sBBX22b基因转录本相对表达水平结果图。其中0sBBX22b-0X表示转0sBBX22b基因的植株，#3、#5、#7、#16和#17代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-Ia作为荧光定量PCR分析的内参基因。
图3为转0sBBX22b基因水稻植株和野生型植株在大田条件及短日条件下开花时间比较图。A图是大田条件下的开花时间，材料生长在山东济南，生长期是2012 年5月-2012年10月；B图是短日条件下的开花时间，短日光周期条件是9小时光照 (30° C±l)/15小时黑暗(27° C±l)。C图是短日条件下转0sBBX22b基因水稻株系(#7) 与野生型植株开花期表型图。其中0sBBX22b-0X表示转0sBBX22b基因的植株，#3、#7和 #16代表三个独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。
图4为转0sBBX22b基因水稻植株和野生型植株生物钟节律比较图。A图是 0sBBX22b基因和生物钟核心组分基因(OsLHY和OsPRRl)在非转基因水稻中的表达模式图； B图是0sBBX22b基因和生物钟核心组分基因(OsLHY和OsPRRl)在0sBBX22b转基因植株中的表达模式图。其中0sBBX22b-0X表示转0sBBX22b基因的植株(#7株系)；WT代表野生型水稻植株。
图5为转0sBBX22b基因水稻植株和野生型植株中开花相关基因的表达水平比较图。其中0sBBX22b-0X表示转0sBBX22b基因的植株，#7和#16代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。Hd3a和RFTl是水稻的两个开花素基因；Hdl和Ehdl是两个开花素基因的上游基因。6:00、10:00、14:00和18:00代表取材时间是上午6点和10点，下午2点和6点。
图6为0sBBX22b基因延迟水稻开花期的机制图。生物钟调控0sBBX22b基因的表达，而0sBBX22b抑制成花素编码基因Hd3a和RFTl基因的表达，从而延迟水稻开花期。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆用于构建0sBBX22b基因植物表达载体的DNA片段，以及验证功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。
实施例I :分离克隆用于构建0sBBX22b基因植物表达载体的DNA片段
采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种日本晴(公开报道的一个品种)的叶片中提取总RNA。具体步骤如下将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入I. 5ml离心管中,迅速加入Iml Trizol (Invitrogen)颠倒混勻,室温静置 5分钟。在4°C，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200 μ I 氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2 — 3分钟。4°C，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的I. 5ml离心管中，加入250 μ I异丙醇，250 μ I高盐溶液，颠倒混匀，室温静置 10分钟。4°C，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置几次，然后4°C，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC 水(一般为60 μ I)溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
利用反转录酶SuperScript II (Invitrogen)将其反转录成cDNA,具体步骤如下 依次加入 I μ 1500 μ g/ml oligo (dT)12_18、2 μ g 总 RNA、I μ IlOmM dNTP 混合物和 DEPC 水至12μ 1，在65°C水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入 4μ 15 X 第一链缓冲液、2 μ 10. IM DTI^Plyl RNaseOUT (40U/μ I )，42°C，2 分钟。然后加入I μ ISuperScript II，轻微混合均匀，42°C反应50分钟，然后70°C水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。用带有酶切位点的上游引物 0sBBX22bF (5’ -ATGGATCCATGTCGCCTCCTCCTCCACCATATTA-3’，SEQ ID N0:3)，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基；和下游引物0sBBX22bR(5’-AACTAGTTTATTGCC TCCGGCGTTTGGAGGTG-3’，SEQ ID NO :4)，序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基。利用 PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)扩增目的片段,PCR 反应条件是94°C预变性I分钟；98°C 10 #,68°C 4分钟，30个循环。利用TArget Clone TM-Plus 试剂盒(Τ0Υ0Β0)在PCR产物末端加A。然后连接到pMD18-T载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO 1所示)，将该克隆命名为pMD18_0sBBX22b cDNA。
实施例2 0sBBX22b基因植物表达载体的构建和遗传转化
为了能更好地分析0sBBX22b的功能，申请人通过过量表达技术使0sBBX22b基因在水稻中表达水平提闻。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。
0sBBX22b基因植物表达载体的构建方法如下首先将实施例I中得到的阳性克隆pMD18-0sBBX22b cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌XLl-Blue。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为 pCAMBIA1390-ubi-BBX22b (见图I)。pCAMBIA1390_ubi是在国际常用的植物遗传转化载体 (见图I)。将pCAMBIA1390-ubi-BBX22b转化至农杆菌菌株EHA105。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良(Hiei等，1994，PlantJ.，6:271-282)。转化共获得18株独立的转基因水稻植株。
具体步骤如下
(I)愈伤诱导去壳的野生型日本晴水稻种子,用70%乙醇表面消毒I分钟；5%(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织(成分见后)，于25-26°C暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。
(2)愈伤组织的预培养将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25_26°C 暗培养4天。
(3)农杆菌培养挑取农杆菌单克隆接种到5mLYEP液体培养基中(含有50mg/L的卡那霉素)，280C，220rpm,培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1% 接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)；28°C, 220rpm,培养至0D600值为O. 5左右(培养5-6小时)。
(4)农杆菌侵染把50mL菌液转入离心管，4°C，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26 0C，黑暗共培养2-3天。
(5)愈伤洗涤和选择培养共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含 500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26°C暗培养2 周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26°C暗培养，每2周继代一次，筛选4周。
(6)分化培养把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28°C光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。
(7)壮苗、移栽将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至IOcm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。
试剂配方
(I)试剂和溶液缩写本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下Cb (Cabenicillin,羧节青霉素);KT (Kinetin,激动素);NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸);2,4_D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4_ 二氯苯氧乙酸);AS (Acetosyringone, 乙酸丁香酮)；DMS0 (Dimethyl sulfoxide, 二甲基亚讽)。
(2)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)YEP液体培养基2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，Ig NaCl，加水定容至200mL，用 5N NaOH 调 PH 至 7. O。
2)愈伤诱导培养基N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，O. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/ L 鹿糖，2mg/L2, 4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH5. 8。
3) AB 液体培养基3g/LK2HP04, lg/LNaH2P04, lg/LNH4Cl, 300mg/LMgS04 · 7H20, 150mg/L KCl, lOmg/L CaCl2 · 2H20, 2. 5mg/L FeSO4 · 7H20，5g/L 葡萄糖，ρΗ7· 0。
4)AAM培养基AA大量，AA微量，0.9g/L L-谷氨酰胺，O. 3g天冬氨酸，MS维生素，O.5g/L 酸水解酪蛋白，36g/L 葡萄糖,68. 5g/L 鹿糖，20mg/LAS, pH5. 2。
5)共培养培养基N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，O. 5g/L 酸水解酪蛋白，2mg/L2, 4_D，20mg/LAS，Gelrite (Sigma) 4g/L，ρΗ5· 8。
6)固体筛选培养基Ν6大量、Ν6微量和Ν6维生素，O. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/L 鹿糖，2mg/L2, 4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH5. 8,合适浓度的潮霉素和羧节青霉素。
7)分化培养基MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L 山梨醇，2mg/LKT，0. 2mg/LNAA, pH5. 8，30mg/L 潮霉素 B，200mg/L 羧苄青霉素。
8) 1/2MS 培养基1/2MS 大量，1/2MS 微量，MS 维生素，30g/L 蔗糖，4g/L Gelrite, 30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH5. 8.
(3)主要溶液配方
I )N6 大量元素(IOX)
KNO328.3 g4.0 g LS5 g 1.66 g 4.63 gKH2PO4MgSO4IH2OCaCl2*2H20(NH4)2SO4
用水定容IL
2) N6 微量(1000X):
MnSOr-IHnOZnSO4TH2OH, BO34.400 g 1.500 g1.600 g 0.800 g 0.250 gNaMo04-2H20
用水定容IL
3)N6 维生素(1000X)
imm盐_硫胺素BI 盐_吡哆素B6烟_肌醇200 mg 100 mg 50 mg 50 mg IOg
用水定容IOOmL
3) MS 大量元素(IOX)
权利要求
1.基因OsBBX22b在延迟水稻开花期方面的应用，所述基因OsBBX22b的DNA序列如SEQID NO 1 所示。
2.如权利要求I所述的基因OsBBX22b在延迟水稻开花期方面的应用，其特征是，基因OsBBX22b过量表达抑制了开花素编码基因Hd3a和RFTl的表达，从而延迟了水稻开花。
3.基因OsBBX22b延迟水稻开花期方面的应用方法，其特征是，通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX22b基因的全长编码区，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表达，得到OsBBX22b基因表达增强的转基因水稻植株，阳性转基因水稻植株在长日条件下和在短日条件下均表现出开花期延迟，所述基因OsBBX22b的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本发明公开了基因OsBBX22b在延迟水稻开花期方面的应用。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX22b基因的全长编码区，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表达，得到OsBBX22b基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，长日条件下阳性转基因水稻植株的开花期较非转基因植株延迟了8-10天，而在短日条件下，转基因水稻的开花时间较非转基因水稻延迟了约15天。本发明利用荧光定量分析结果表明，OsBBX22b过量表达抑制了开花素编码基因Hd3a和RFT1的表达，从而延迟了水稻开花。
文档编号A01H5/00GK102978217SQ20121057269
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者谢先芝, 周晋军, 王盈盈, 赵杰, 吴修 申请人:山东省水稻研究所