一种鉴定水稻Wx-mw基因的方法及其在优质水稻培育中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种鉴定水稻低直链淀粉含量突变基因 Wx-mw不同基因型的四引物PCR分子标记方法以及利用该分子标记培育具优良食味品质水 稻品种的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻作为我国乃至世界范围内的重要粮食作物对保障我国粮食安全具有重要的 作用。近几十年来，我国水稻产量不断提高，尤其是随着国民消费水平和生活品味的提高， 对多样化优质稻米的需求越来越多。
[0003] 稻米品质表现为多样性，就优质食用而言，主要包括碾磨品质、外观品质、蒸煮与 食味品质和营养品质四个方面，这些品质性状直接决定了稻米的商品价值和消费者的消费 行为。蒸煮与食味品质稻米品质构成中的最重要方面，由于胚乳是稻米的主要食用部分，而 其中的淀粉又是其主要组份。因此，淀粉的组成与结构尤其是直链淀粉的含量是决定稻米 蒸煮与食味品质的最重要因素（Tian等，PNAS. 2009(51)21760-21765)。
[0004] 由水稻蜡质基因（Waxy，Wx)编码的颗粒结合淀粉合成酶GBSSI主要负责 直链淀粉的合成，该基因的不同等位变异决定了稻米直链淀粉含量的多少（Wang等， PlantJournal. 1995(4) 613-622)。截止目前至少有7个已发表的Wx等位基因。在 懦稻中，由于第二外显子中缺失23bp造成了wx转录提前终止（Wanchana等，Plant Science. 2003 (6) 1193-1199)。在非糯品种中，Wx基因主要分化为Wx-a和Wx-b两种等 位类型。其中，携带Wx-a的稻米直链淀粉含量都很高（25%以上），属于高直链淀粉类 型。Wx-b主要分布在粳稻品种中，携带该基因稻米的直链淀粉含量属中等至较低水平 (15-18%左右）。与Wx-a相比，Wx-b的变异是由第一内含子剪接位点处G-T变异造成的， 突变降低了前体mRNA的剪接效率从而减少了GBSSI的量进而导致了较低的直链淀粉含量 (Wang等，PlantJournal. 1995(4)613-622)。此外，Mikami等克隆了Wx_in等位基因，证 明在第六外显子上发生的A-C变异使直链淀粉含量降至中等水平（18-20% ) (Mikami等， TheorApplGenet. 2008(7)979-989)。除了上述常规等位基因外，还有3个"暗胚乳基因" 被克隆，即Wx-mq、Wx-mp和Wx_op。与Wx_b相比，Wx-mq在第四和第五外显子处存在两处 突变，导致直链淀粉含量降到10 %左右（Sato等，BreedingResearch. 2001 (3) 13-19)。 等位基因Wx-mp，是在Wx-mq基础上第五外显子发生了回复突变，携带该等位基因的稻米 直链淀粉含量也在10%左右（Yang等，PlantBreeding.2013(6)595-603)。另一个软米 基因为Wx-〇p(或者Wx-hp)是由第4外显子的A-G突变造成的（Mikami等，TheorAppl Genet. 2008(7)979-989)。
[0005] 低直链淀粉含量基因是进行低直链淀粉水稻品种选育的重要遗传资源。在水稻 中，携带暗胚乳基因Wx-mp、Wx_mq和Wx-op的稻米具有非常好的食味表现。利用这些等位基 因，目前已选育出了很多具有优良食味品质的优质稻米，如江苏最好吃大米"南粳46"（王 才林等，中国水稻科学.2009, 23 (I) 25-30)。然而由于直链淀粉含量较低，这类稻米在 含水量低的时候表现为云雾状、乳白色、透明度差等暗胚乳的特性（SatoH等，Breeding Sci，2002, 52(2) 131-135)，严重影响了稻米的外观品质。因此，通过挖掘特定的Wx等位变 异基因，使得稻米在适当降低直链淀粉含量、具有优良食味表现的基础上，保持优良的外观 品质，是水稻品质改良的重要基础。
[0006] 发明人在前期研究中分离克隆了水稻中一个新的控制低直链淀粉含量的Wx等位 基因Wx-mw，该基因来源于籼稻品种魔王谷。通过直链淀粉测定，携带Wx-mw的水稻直链淀 粉含量在13%左右，显著低于含Wx-b的常规水稻品种、但略高于暗胚乳稻米（10%左右）。 因此，Wx-mw在优良食味稻米新品种的培育中具有重要的应用价值。
[0007] 目前，基于DNA变异的分子标记在水稻遗传改良中发挥了非常重要的作用。在水 稻品质改良研究方面，不同的研究者已针对不同的Wx等位基因开发出了相应的分子标记， 如分别针对第一内含子和第六外显子SNP变异位点开发出了基于限制性内切酶的CAPS分 子标记（Chen,JournalofCerealScience. 2008 (48) 781-788)，针对水稻暗胚乳突变基因 Wx-mq开发了显性PCR分子标记（Sato等，BreedingSci. 2002 (52) 131-135)和CAPS分子 标记等（Chen等，RiceSci. 2009 (16) 106-110)。上述分子标记尤其是CAPS标记操作繁琐， 且常常存在酶切不完全现象而造成难以准确鉴定不同的基因型的现象。有关Wx-mw等位基 因目前并未见报道，也没有相关分子标记的开发。因此，建立一种基于PCR技术的快速、准 确鉴定水稻低直链淀粉含量突变基因Wx-mw的分子标记是加快该新等位基因在稻米品质 改良应用中的重要工具。
【发明内容】
[0008] 本发明针对发明人前期分离克隆的水稻中一个新的控制低直链淀粉含量突变基 因Wx-mw的特异突变位点，即在Wx第一内含子剪切位点G和T的差异以及第六外显子第62 个碱基位点上A和C的差异，开发出了一种基于四引物扩增受阻突变体系PCR的特异分子 标记，特异地用于鉴定Wx-mw基因。该分子标记与低直链淀粉含量性状完全连锁，在水稻生 长的任何时期任何组织均可对其进行基因型检测。
[0009] 本发明公开了 Wx-mw等位基因第一内含子第二个碱基和Wx-mw等位基因第六外显 子62bp的碱基作为鉴定水稻Wx-mw基因的分子标记的应用。
[0010] 本发明还公开了一组用于鉴定水稻Wx-mw基因的特异性引物，其特征在于，由下 列4对引物组成：
[0011] ⑴分子标记1的两对引物：
[0012]正向外引物Wx-mw-〇utl-F:5'-AAGTCGGmTGCmTGGIT-3'（SEQ IDNO. 1)，
[0013]反向外引物Wx_mw-〇utl-R:
[0014] 5'-CCCCTGGGTATGTTTCTCTAGACTCT-3'（SEQ IDNO. 2);
[0015]正向内引物Wx-mw-inl-F:
[0016] 5,-TTCATCAGGAAGAACATCTGCTAGG-3,（SEQ IDNO. 3)，
[0017]反向内引物Wx-mw-inl-R:5' -GGAAACAAAGAATTATAAACAAATATGTAGAA-3'（SEQ ID NO. 4)；
[0018] 所述分子标记I是指Wx-mw等位基因第一内含子第二个碱基位点；
[0019] (2)分子标记2的两对引物如下：鉴定Wx-mw与Wx-a/b/mq/mq/op的两对正向外
[0020] 反向外引物Wx-mw-〇ut2-R:5'-GTAGATGCCAITGGGCTGGTAGT-3'（SEQIDNO. 6)
[0021] 正向内引物Wx-mw-in2-F: 5' -AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'（SEQIDNO. 7)
[0022] 反向内引物Wx-mw_in2-R:
[0023] 5,-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3,（SEQIDNO. 8);
[0024] 所述分子标记2是指Wx-mw等位基因第六外显子62bp的碱基位点。
[0025] 本发明还提供了一种鉴定水稻Wx-mw基因的方法，用上述的4对引物扩增水稻品 种的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下观察DNA条带的大小来鉴定Wx-