'端剪切位点处 TT 与 GG 的差异进行区分。Wx-mw 与 Wx_in, wx，Wx_a，Wx_b，Wx-mq, Wx-mp 和 Wx-op 等位基 因的鉴定可利用分子标记2对第六外显子处C-A的差异进行区分。
[0045] 以不同水稻DNA为模板，利用在同一PCR反应体系中加入4对特异引物对不同 水稻品种DNA扩增，20yLPCR反应体系包括：50ng/yL的DNA1. 0yL，IOpmol/yL的引 物 2yL，其中引物Wx-mw-out-F、Wx_mw-〇ut-R、Wx-mw-in-F和Wx-mw-in-R各 0? 5yL，含 25mmol/L]\%(：12的 10XPCRBuffer2. 0yL，2. 5mmol/L的dNTP0? 4yL，5U/yL的rTaq 0? 5yL和ddH20 14.IyL。PCR反应程序包括：95°C预变性5min;然后95°C变性40s、55°C 复性30s、72°C延伸50s，循环35次；然后72°C延伸5min，15°C冷却5min后，将扩增产物加 上样缓冲液终止反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下观察DNA条带的大小 来鉴定Wx-mw等位基因。
[0046] 对于Wx-mw与Wx-a/in的区分，分别以魔王谷（Wx-mw)、南京11 (Wx_a)、 IR64 (Wx-in)(江苏省农业种质资源中期库提供）以及由魔王谷分别与南京11和IR64杂交 所获得的Fl不同个体基因组DNA为模板进行PCR分析，如果分子标记1有357bp特征条带 即为低直链淀粉含量突变基因Wx-mw纯合体，如果分子标记1有280bp特征条带即为不含 低直链淀粉含量突变基因Wx-mw纯合体；如果分子标记1同时含有357bp和280bp特征条 带，则为低直链淀粉含量突变基因Wx-mw的杂合体（图5A)。
[0047] 对于Wx-mw与Wx-a/b/mq/mp/op的区分，分别以魔王谷（Wx-mw)与梗稻 2661(Wx-b)及其杂交F2后代不同个体基因组DNA为模板，如果分子标记2有511bp和 209bp两条特征条带即为低直链淀粉含量突变基因Wx-mw纯合体；如果分子标记2有511bp 和302bp两条特征条带即为不含有低直链淀粉含量突变基因Wx-mw的纯合体；如果分子标 记2同时存在511bp、292bp和302bp的三条特征条带，则为低直链淀粉含量突变基因Wx-mw 的杂合体（图5B)。
[0048] 在严谨条件下可通过PCR-测序法鉴定，即将PCR扩增的不同长度片段进行序列测 定，从而确定突变位点是何种碱基。
[0049] 实施例3分子标记辅助选育低直链淀粉含量水稻新品系
[0050] 本发明提供一种思路以携带Wx-mw基因的水稻植株（如水稻魔王谷）为供体亲 本，以待改良的水稻品种或品系（如2661)为轮回亲本，进行连续回交选育。在低世代用实 施例2中的与目标基因Wx-mw基因及其控制低直链淀粉含量性状相连锁的分子标记2进行 辅助选择，在高世代群体中可结合直链淀粉含量加以选择，经过一定的世代后可以选育出 既保留原来待改良亲本优良的性状，又具有低直链淀粉含量的优良食味品质的新品种或新 品系。
[0051] 本发明通过将Wx-mw基因导入粳稻品系2661。具体以魔王谷（携带Wx-mw基因的 籼稻品种）为供体亲本，以2661 (携带Wx-b)为受体亲本。经过杂交、回交，结合分子标记 辅助选择，选出了一个含有Wx-mw基因供体片段的改良系（图6A)。通过分子标记背景检 测（Zhang等，JGenetGenomics. 2011 (38)603-611)，证明该改良系遗传背景与2661基本 一致。
[0052] 对改良新品系的农艺性和品质性状中的直链淀粉含量和胶稠度进行了分析，数据 显示，改良系在株型、生育期等主要农艺性状方面与对照亲本没有显著差异（图6A)，而在 品质性状方面，改良系的表观直链淀粉含量极显著低于对照亲本，说明改良系稻米的直链 淀粉含量得到了显著的改良。同时，稻米品质性状中的另一个重要指标胶稠度在改良系中 也较对照亲本极显著改善，表现为米胶明显变软（图6B-C)。
[0053] 上述结果表明Wx-mw等位基因能够明显改良稻米的直链淀粉含量并进而改善稻 米的食味品质，因此在优良食味品质水稻培育中具有很好的应用。
【主权项】
1. Wx-mw等位基因第一内含子第二个碱基和Wx-mw等位基因第六外显子62bp的碱基作 为鉴定水稻Wx-mw基因的分子标记的应用。2. -组用于鉴定水稻Wx-mw基因的特异性引物，其特征在于，由下列4对引物组成： (1) 分子标记1的两对引物： 正向外引物Wx-mw-〇utl-F:5' -AAGTCGGmTGCmTGGIT-3'， 反向外引物Wx-mw-outl-R:5'-CCCCTGGGTATGITTCTCTAGACTCT-3'； 正向内引物Wx-mw-inl-F:5'-ITCATCAGGAAGAACATCTGCTAGG-3'， 反向内引物Wx-mw-inl-R:5'-GGAAACAAAGAATTATAAACAAATATGTAGAA-3'； 所述分子标记1是指Wx-mw等位基因第一内含子第二个碱基； (2)分子标记2的两对引物如下：鉴定Wx-mw与Wx-a/b/mq/mq/op的两对 正向外引物Wx-mw-〇ut2-F: 5' -GCTTAGCTTCCACTGGTGAITTCA-3' 反向外引物Wx-mw-〇ut2-R:5' -GTAGATGCCAITGGGCTGGTAGT-3' 正向内引物Wx-mw-in2-F: 5' -AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3' 反向内引物Wx-mw-in2-R: 5'-TCTTGAGATCAAITGTAACTCCCCAT-3'； 所述分子标记2是指Wx-mw等位基因第六外显子62bp的碱基。3. -种鉴定水稻Wx-mw基因的方法，其特征在于： 用权利要求2所述的4对引物扩增水稻品种的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳后在紫外 光下观察DNA条带的大小来鉴定Wx-mw基因； 对于Wx-mw与Wx-a，Wx_in的区分：如果分子标记1有357bp特征条带即为低直链淀粉 含量突变基因Wx-mw纯合体，如果分子标记1有280bp特征条带即为不含低直链淀粉含量 突变基因Wx-mw纯合体；如果分子标记1同时含有357bp和280bp特征条带，则为低直链淀 粉含量突变基因Wx-mw的杂合体； 对于Wx-mw与Wx-a/b/mq/mp/op的区分：如果分子标记2有511bp和209bp两条特征 条带即为低直链淀粉含量突变基因Wx-mw纯合体；如果分子标记2有51 Ibp和302bp两条 特征条带即为不含有低直链淀粉含量突变基因Wx-mw的纯合体；如果分子标记2同时存在 511bp、292bp和302bp的三条特征条带，则为低直链淀粉含量突变基因Wx-mw的杂合体。4. 水稻基因Wx-mw分子标记在培育具低直链淀粉含量水稻品种中的应用，其特征在于 所述水稻基因Wx-mw分子标记是Wx-mw等位基因第一内含子第二个碱基和Wx-mw等位基因 第六外显子62bp的碱基。
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定水稻Wx-mw基因的方法及其在优质水稻培育中的应用。公开了Wx-mw等位基因第一内含子第二个碱基和Wx-mw等位基因第六外显子62bp的碱基作为鉴定水稻Wx-mw基因的分子标记的应用。根据第一内含子剪接位点突变和第六外显子处的突变位点分别设计四条标记引物，分别加入同一PCR反应体系对不同水稻DNA扩增。对于Wx-mw与Wx-a，Wx-in的区分利用这两种四引物分子标记进行辅助选择、结合常规杂交和回交方法将Wx-mw导入目标品种中，可用于培育具较低直链淀粉含量的优良食味品质水稻新品种。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105087573
【申请号】CN201510582799
【发明人】刘巧泉, 张昌泉, 李钱峰, 周兴忠, 顾铭洪
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月14日