一种营养不良型大疱性表皮松解症核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及少见的单基因遗传性皮肤病-大疱性表皮松解症的检测。特别是一种 营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 遗传性大疱性表皮松解症（Epidermolysisbullosa，EB)是一种少见的单基因遗 传性皮肤病，呈常染色体显性(AD)或隐性(AR)遗传。特征性表现为皮肤脆性增加，皮肤受 到轻微摩擦即可导致皮肤分层，通常在数分钟内发生紧张水疱、糜烂和结痂。其致病原因主 要是由于编码皮肤蛋白的基因出现了突变，导致蛋白质结构异常或皮肤结构蛋白先天性缺 陷，使表皮发生松解，关节伸侧等易受外力摩擦部位出现大疱。大多数患者在婴儿期开始发 病，少数病例成年出现症状。
[0003] 大疱性表皮松解症由vonHebra于1870年首先描述，1886年德国Koebner首 次报告并命名了大疱性表皮松解症。有关EB的诊断和分类意见，多次在国际会议上提 出并不断得到补充。2007年在最新的分子遗传学研究基础上第三次研讨会对既往的认 识进行完善和修正，这一新的分类标准己于2008年6月正式发布。根据透射电镜超微 结构以水疱在皮肤中的位置为标准，最新的分类方法将EB分为单纯型（epidermolysis bullosasimplex,EBS)、交界型（junctionalepidermolysisbullosa,JEB)、营养不良型 (dystrophicepidermolysisbullosa,DEB)和Kindler综合征四个临床类型，各型又包括 不同的亚型(表1)。
[0004] 表IEB的主要临床类型及亚型
营养不良型大疱性表皮松解症（DEB)是一种会形成瘢痕的EB，水疱位于皮肤的深层组 织，真皮上层的致密板下。将DEB分为显性遗传（DDEB)和隐性遗传（RDEB)两大亚型。DEB 组织病理表现为表皮下水疱，疱内及真皮炎症细胞浸润不明显，常见囊肿样结构。透射电镜 观察显性DEB可见致密板下裂隙，锚纤维数量减少，而隐性DEB锚纤维明显减少或消失。
[0005] 分型：与原来的分类相比，隐性遗传的Hallopeau-Siemens(RDEB-HS)改称重症泛 发型RDEB(RDEB-Sevgen)，非Hallopeau-Siemens型RDEB(RDEB-nHs)改称为其他泛发型 RDEB(RDEB-O)，（表 2) 表2DEB的主要临床类型
(一） 显性遗传型DEB(DDEB):響泛发型DDEB(DDEB-Gen)議肢端型DDEB(DDEB-Ac) 藝胫前型DDEB(DDEB-Pt)顯痒疹型DDEB(DDEB-Pr)議甲局限型DDEB(DDEB-Na)I1新生 儿大疱性表皮松解DDEB(DDEB-BDN)。 (二） 隐性遗传型DEB(RDEB) = (I)重症泛发型RDEB(RDEB-Sevgen) (2)其他泛发型RDEB(RDEB-O) (3)反相型RDEB(RDEB-I) (4)胫前型RDEB(RDEB-Pt) (5)痒疹型RDEB (RDEB-Pr) (6)向心型RDEB(RDEB-Pt) (7)新生儿大疱性表皮松解RDEB(RDEB-BDN)。
[0006] 胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt) 胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt)是DEB中一罕见临床亚型， 1946年Kuske报道1例发生于胫前区的瘙痒性水疱、萎缩及瘢痕的DEB，称为胫前DEB。出 生时即可发生，亦可在婴儿期或儿童期发病。主要发生于胫前、前臂，少数亦可发生于躯干。 瘙痒明显，可见瘢痕、粟丘疹及甲营养不良。成人期损害可呈苔藓样斑块。病情呈慢性进行 性发展，尤其进入青春期后加重。血中IgE水平可增高。需与肥厚性扁平苔藓、皮肤淀粉样 变及人为皮炎鉴别。
[0007] DDEB-Pt致病基因VII型胶原（C0L7A1)。VII型胶原是三个相同的a1链构成的 同源三聚体，每一a1多肽链含有中央胶原性三螺旋区，两侧为非胶原性氨基端和梭基端。 胶原性结构区由特征性Gly-X-Y重复序列构成三螺旋结构域。VII型胶原基因（C0L7A1)定 位于3p21. 1，由118个外显子组成（GenbankNo:L23982)，是迄今报道的外显子最多的基 因。绝大多数DDEB的基因突变均为甘氨酸替换突变(某一碱基的点突变导致甘氨酸被其它 氨基酸替换)。
【发明内容】
[0008] 本发明公开了一种营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸，该核苷酸C0L7A1基 因定位于3号染色体3p21. 1区域，由118个外显子组成，具有SEQIDNO: 1所示的核苷酸 序列。
[0009] 本发明进一步公开了营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸在制备检测成人、婴 儿营养不良型大疱性表皮松解症中的应用。其中遗传性大疱性表皮松解症指的是单基因遗 传性皮肤病。表现为皮肤脆性增加，皮肤受到轻微摩擦即可导致皮肤分层，通常在数分钟内 发生紧张水疱、糜烂和结痂。
[0010] 本发明公开的营养不良型大疱性表皮松解症新发基因，C0L7A1基因定位于3号 染色体3p21. 1区域，由118个外显子组成，具有（GenbankNo:L23982)，是迄今报道的外显 子最多基因。1993年BurgesonRE首次报道了C0L7A1基因是DEB致病基因，1994年国外对 C0L7A1进行研究测序，发现了完整的C0L7A1基因结构组成，为DEB突变的研究奠定了基础。 据统计到目前为止报道的C0L7A1基因突变点总共有730多个（http://www.col7.info)。 大部分C0L7A1基因突变具有极大的种族及家系特异性，而复发性突变也可见于数个种族， 如意大利人常见突变为 497丨1184、8441-14(16121、47836-4、616644、73446-4和4254-(：;墨西 哥人常见突变为24700insG;英国人常见突变为R578X、778delG和R2814X;日本人常见突 变为5818delC、6573-lG-t〇-C和E2857X。到目前为止，在DDEB-pt中有6个致病突变被鉴 定。分别为1995年ChristianoAM等报道了 1个DDEB-pt家系中C0L7A1基因105号外显 子p.Gly2623Cys甘氨酸替换突变；1998年KonA等报道了 1个DDEB-pt家系中C0L7A1基 因108号外显子c. 8045A>G外显子跳跃突变；1999年BettsCM等报道了 1个RDEB-pt 家系中C0L7A1基因115号外显子g. 33563-33576del/ND缺失突变；2002年GardellaR等 报道了 1个RDEB-pt家系中C0L7A1基因55号外显子c. 267-1G>C/p.Prol699Leu错义突 变；2009年HamadaT等报道了 1个DDEB-pt家系中C0L7A1基因73号外显子p.Gly2059Glu 甘氨酸替换突变和2013年LiuYH等报道了 1个中国DDEB-pt家系中C0L7A1突变基因73 号外显子c. 6101G>T错义突变。
[0011] 本研究中，我们在1例DDEB-pt散发患者中检测到c.G6109A(p.Gly2037Arg)甘 氨酸替换突变，是一个新发突变(第7个)，即患者C0L7A1基因73号外显子的6109位点鸟 嘌呤（G)转化为腺嘌呤（A)，使得三螺旋区第2037位密码子由GCT变成ACT，编码氨基酸由 甘氨酸（Gly)变为精氨酸（Arg)，在家族正常人及正常对照中均未检测到。
[0012] 本发明对中国汉族1例胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt) 散发患者进行详细临床资料调查并对基因突变进行检测，检测到1个C0L7A1基因甘氨酸 替换突变c.G6109A(p.Gly2037Arg)。并证实这个突变为致病性突变，系国内外首次报道。 DDEB-Pt散发患者是否存在denovo突变，有待进一步深入研究和探讨。本研究扩充了中国 汉族人营养不良型大疱性表皮松解症的遗传及临床数据库，为患者的遗传咨询、产前诊断 及基因治疗等奠定了基础。
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【附图说明】： 图 1 为C0L7A1-ZZS(1-lOthprimers); 图 2为C0L7Al-ZZS(ll-17thprimers); 图 3 为C0L7Al-ZZS(18-25thprimers); 图 4 为C0L7Al-ZZS(26-41thprimers); 图 5 为 C0L7Al-ZZS(42-56thprimers); 图 6 为 C0L7Al-ZZS(57-73thprimers); 图 7 为 C0L7Al-ZZS(74-87thprimers); 图 8 为 C0L7Al-ZZS(88-104thprimers); 图 9 为 L7A1-ZZS(105-118thprimers);