一种环状rna人工过表达框架及其表达载体及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA人工过表达框架及其表达载 体和构建方法。
【背景技术】
[0002] 生物体内的环状RNA(CircularRNA)是一类具有特殊功能的RNA分子，而且是客 观大量存在的。环状RNA(circRNA)由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形 成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序 及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子， 环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有 明确，目前只有几种假定的说法：⑴环状RNA可以作为"sponge"海绵吸miRNA，抑制其功 能；（2)环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；（3)环状RNA能与蛋白质结合， 抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；（4)环状RNA也可作为翻 译的模板指导蛋白质的合成。
[0003] 基因是具有遗传效应的核苷酸序列，研究特定分子的功能中通过克隆表达基因对 研究者来说具有重要意义。为了使克隆的基因在宿主细胞中大量表达，就要依据不同的实 验目的选择不同的表达系统，构建不同的表达框架。克隆基因在不同的系统中表达的成功 率取决于我们对这些系统中基因表达调控规律的认识程度，以及合理的实验设计。过表达 线性的基因技术方法已经非常成熟，可以把要克隆的基因通过PCR技术获得，然后直接连 接到表达载体中即可；但是人工过表达环状的RNA分子还存在不少问题，比如：如何人工地 使RNA分子在特定位点发生准确环化，从而使生物体内的环状RNA可以通过外显子上下游 的内含子发生配对，形成局部双链的RNA，然后通过细胞内的RNA体的剪接生成环状的RNA。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效表达环状RNA的 环状RNA人工过表达框架。
[0005] 本发明的另一个目的是提供含有上述环状RNA人工过表达框架的表达载体。
[0006] 本发明的再一个目的是提供所述环状RNA人工过表达框架的构建方法。
[0007] 本发明的再一个目的是提供所述环状RNA人工过表达框架的应用。
[0008] 本发明的再一个目的是提供一种人工表达目的基因的方法。
[0009] 为此，本发明提供了一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQIDNO. 1所述的 核苷酸序列。
[0010] 根据本发明的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、填充序 列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点。
[0011] 术语"上游框架序列"指的是：框架中从第1个碱基算起到492个碱基结束的区域 核酸序列。
[0012] 术语"下游框架序列"指的是：框架中从第636个碱基算起到1017个碱基结束的 区域核酸序列。
[0013] 术语"填充（stuffer)序列"指的是：框架中存在于Kpnl、BamHI内切酶中间的核 酸序列，用于替换目标序列；如果没有填充（StufTer)序列，Kpnl、BamHI紧连着，不容易 做酶切。
[0014] 优选地，所述环状RNA插入酶切位点包括NheI、KpnI、BamHI和XhoI。
[0015] 其中，该过表达框架的碱基序列中，第1~492bp为上游框架序列，第493~635bp 为填充序列，第636~1017bp为下游框架序列，其中，第1~6bp、487~492bp、636~ 641bp、1012 ~1017bp依次为酶切位点NheI、KpnI、BamHI、XhoI。
[0016] 本发明还提供了一种包括所述环状RNA人工过表达框架的表达载体。
[0017] 优选地，所述的表达载体为真核表达载体。
[0018] 本发明还提供了一种环状RNA人工过表达框架的构建方法，该方法包括以下步 骤：设计扩增引物，以人的J1EK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增 过表达框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全长序列两端分别添加NheI、 XhoI酶切位点序列，方便将整个过表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端添加KpnI 和BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。
[0019] 优选地，在该构建方法中，所述扩增引物分为三段，其核苷酸序列如下：
[0020] 1)第一段扩增上游框架引物：
[0021] Up-F :5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA3'，
[0022] Up-R :5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'；
[0023] 2)第二段扩增填充序列引物：
[0024] stuffer-F : 5'GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC3'，
[0025] stuffer-R：5'TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3'；
[0026] 3)第三段扩增下游游框架引物：
[0027] Down-F :5'TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3'，
[0028] Down-R :5'GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3' 〇
[0029] 优选地，在该构建方法中，所述分段PCR扩增的反应体系如下：第一轮PCR为 20y1总体系，PCR分别扩增：具体是2XPCRMIXIOy1，IOmM上下游引物各Iy1，HEK293 细胞DNA模板Iy1，用灭菌水补足20y1体系；第一轮反应条件为：95°C5min预变性，循环 内95°C30s变性，60°C30s退火，72°C延伸40s，共35个循环，PCR反应循环后72°C继续延伸 7min，然后20°C保存；第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物Iy1进行第二轮重叠PCR 扩增反应，具体反应体系是50y1 :具体是2XPCRMIX25yI，IOmM的Up-F和Down-R引物 各2. 5y1，第一轮PCR产物各段产物总共3y1，用灭菌水补足50y1体系；第二轮反应条件 为：95°C5min预变性，循环内95°C30s变性，60°C30s退火，72°C延伸lmin，共40个循环， PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后20°C保存。
[0030] 本发明所述的环状RNA人工过表达框架应用于人工表达目的基因。
[0031] 本发明还提供了一种人工表达目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除所 述环状RNA人工过表达框架（具有如SEQIDNO. 1所述的核苷酸序列）中的填充序列，然 后直接将目标基因的核苷酸序列连接到所述环状RNA人工过表达框架中进行表达。
[0032] 本发明根据环状RNA天然形成的分子分子机理，设计环状RNA的人工过表达框架， 该框架包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、环状RNA插入酶切位点。本框架可以 成功地使目标RNA分子发生特定位点的环化，使用者可以直接将需要环化的基因的线性核 苷酸序列通过酶切位点直接连接到表达框架中，通过载体导入细胞中就可以获得目标环状 RNA分子。本发明构建的环状RNA人工过表达框架为广大科研工作者提供了一种有效表达 环状RNA的工具。此外，将本发明构建的环状RNA人工过表达框架构建到特定的真核表达 载体中，载体转染细胞后，可以在细胞内通过RNA剪接形成环状的RNA分子，为环状RNA的 生物学功能研究提供一种不可缺少的技术方法。
【附图说明】
[0033] 图1是根据本发明的环状RNA人工过表达框架的组成示意图。
[0034] 图2是根据本发明的环状RNA人工过表达框架的PCR扩增琼脂糖电泳图。
[0035] 图3是含有根据本发明的环状RNA人工过表达框架的真核表达载体的图谱。
[0036] 图4是根据本发明的环状RNA人工过表达框架的荧光定量检测结果。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保 护范围并不限于此。
[0038] 实施例：构建环状RNA人工过表达框架
[0039] 一、设计环状RNA人工讨表汰框架
[0040] 本发明设计环状RNA人工过表达框架包括上游框架序列、填充序列、环状RNA插入 酶切位点、下游框架序列。该框架的组成示意图如图1所示。该框架的碱基序列如SEQID NO. 1所示。其中，该框架的碱基序列中，第1~492bp为上游框架序列（碱基长度共492bp)， 第493~635bp为框架填充（stuffer)序列（碱基长度共143bp)，第636~1017bp为下游 框架序列（喊基长度共382bp)，第1~6bp、487~492bp、636~641bp、1012~1017bp依 次为酶切位点（NheI、KpnI、BamHI、XhoI)。
[0041] 二、环状RNA人工讨表汰框架序列的获得
[0042] 根据上述环状RNA人工过表达框架的设计方案，通过设计扩增引物，以人的 HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增过表达框架的上游框架序 列、下游框架序列，及填充序列共1017BP，在全长序列两端分别添加NheI、Xh〇I酶切位点序 列，方便将整个过表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端分别添加KpnI和BamHI酶 切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。
[0043] 具体的实施方案如下：
[0044] 1、设计PCR扩增引物如下（分3段扩增引物设计）：
[0045] (1)第一段扩增上游框架引物
[0046] Up-F:5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA 3'（SEQ ID NO. 2)
[0047] Up-R:5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'（SEQ ID NO. 3)
[0048] 第一段扩增大小为505bp ;
[0049] (2)第二段扩增填充序列引物
[0050] stuffer-F:5'GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC3'(SEQIDNO. 4)
[0051] stuffer-R:5'TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3'（SEQIDNO. 5)
[0052] 中间端扩增填充序列，扩增大小为169bp ;
[0053] (3)第三段扩增下游游框架引物
[0054] Down-F:5'TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3'（SEQIDNO. 6)
[0055] Down-R:5'GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'（SEQIDNO. 7)
[0056] 第一段扩增大小为396bp。
[0057] 2、PCR扩增环状RNA过表达框架
[0058] 用上述引物配合如下反应体系：第一轮PCR为20yl总体系，PCR分别扩增：具 体是2