一种新型酵母诱导型启动子及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种新型酵母诱导型启动子及其应用。

背景技术：

细胞中基因的表达受到多种因素的影响，如顺式作用元件、反式作用因子等，在细胞生长阶段，与rna聚合酶相联系的转录因子的表达水平及其它基因水平的调节有关。其中，启动子是启动特定基因转录的dna序列，是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子功能的强弱对于目的基因的表达至关重要。

启动子含有特异性dna序列，例如给rna聚合酶和招募rna聚合酶的转录因子提供可靠的初始结合位点。通常增高一个基因的表达量，会给它添加一个组成型的强启动子或诱导上调的启动子，降低或关闭一个基因的表达，会给添加一个弱启动子或诱导下调的启动子。通过更换启动子来调节基因的表达在改变酵母的代谢途径中得到了广泛应用。

酵母启动子有以下几种类型：(1)组成型：是指能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动子，其不受外界条件的影响。这类启动子不需要诱导物或抑制物，所启动基因的表达具持续性。(2)诱导型：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子能同时控制基因的表达量和基因的表达时间。在酿酒酵母中，一系列多种多样的内源诱导型启动子和改造过的诱导型启动子已被成功应用于基因表达的调控。其中在酿酒酵母中，最为严谨的调控性启动子是来自半乳糖诱导的基因gal1、gal7、gal10。

上述两种酵母启动子中组成型启动子不表现时空特异性，不受诱导物的调控，不能随时调控基因的表达；诱导型启动子在酵母中最常用到的是pgal1,它可以被半乳糖诱导，但是在培养中需要先进行棉子糖饥饿处理后半乳糖诱导，更换培养基耗时耗力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型酵母诱导型启动子及其应用。

为实现上述发明目的，本发明是通过如下措施实现的：一种新型酵母诱导型启动子，为序列表中序列1所示的dna序列；该启动子长度为673bp。

其中，制备过程为：

(一)酿酒酵母的基因组dna提取：

①、收集5ml酵母细胞，离心(16000g,15s)后弃上清，加230uldna裂解液重悬菌体；

②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，涡旋3min；其中，苯酚、氯仿和异戊醇的质量份数比为25:24:1；

③、离心(16000g,5min)后将水层转移到一个新的ep管中；

④、加600ul冰乙醇洗剂dna,然后将ep管放在-20℃中30min；

⑤、在4℃下离心收集dna(16000g,15min)，弃乙醇，在空气中干燥3min；

⑥、用200ulte重悬dna,加5ulrna酶后37℃孵育10min；

⑦、加5mnacl8ul和两倍体积的冰乙醇，在-20℃放置30min；离心(16000g,15min)后弃乙醇，放在空气中干燥；

⑧、用水/te重悬dna,得到酵母基因组dna；

(二)用高保真phusion酶pcr扩增得到ddi2启动子：

pcr体系的总体积50μl，其中phusion0.5μl、phusionbuffer10μl、dntpmix2μl、模板100ng、上游引物(浓度10μm)1μl、下游引物(浓度10μm)1μl、h2o补足到50μl；prc反应条件为：98℃、1min条件下进行预变，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此进行30个循环，然后在72℃、10min进行扩增，扩增得到ddi2启动子。

其中，所述引物对的序列如下：

u1:5’-tctaagataaaacacagatcgac-3’

u2:5’-gattgattcttttgaagagaagc-3’。

另外，本发明还提供了所述的酵母诱导型启动子在调控酵母基因表达中的应用：所述酵母为酿酒酵母。

其中，诱导物为氰胺。

其中，所述氰胺的浓度为5-8mm。

本发明的有益效果为：本发明的新型的酵母诱导型启动子ddi2，其可被氰胺高效诱导，启动子强度与已知诱导型强启动子gal1相近，比组成型启动子adh1强，且不用更换培养基，可通过诱导时间和诱导剂的量控制基因的表达量，与常用的gal1启动子相比在时间成本和价格成本上更具优势。本专利将ddi2启动子与传统的酵母组成型启动子adh1及诱导型启动子gal1相比较，首先构建三种“启动子-sfgfp”的单拷贝质粒并转入酵母w303中，然后用荧光共聚焦显微镜拍照，并用流式细胞仪(fcm)检测荧光表达。流式细胞仪检测结果显示ddi2启动子强度大于adh1启动子,与gal1启动子强度相近，且所需诱导时间少于gal1启动子，不用更换培养基；并且ddi2启动子强度在诱导物氰胺浓度为5-8mm下强度最大。

附图说明

图1为构建ycplac111-padh1-sfgfp的质粒图谱。

图2为构建ycplac111-pgal1-sfgfp的质粒图谱。

图3为构建ycplac111-pddi2-sfgfp的质粒图谱。

图4为三种启动子调控sfgfp表达在共聚焦显微镜下的结果。

图5为两种启动子在不同时间下调控荧光的表达强度。

图6为ddi2启动子在不同浓度氰胺诱导下的荧光强度。

图7为不同浓度氰胺诱导下ddi2调控sfgfp在翻译水平的表达情况。

序列1为ddi2启动子；

序列2为adh1启动子；

序列3为gal1启动子。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

本发明是通过如下措施实现的：一种新型酵母诱导型启动子，为序列表中序列1所示的dna序列；该启动子长度为673bp。

其中，制备过程为：

(一)酿酒酵母的基因组dna提取：

①、收集5ml酵母细胞，离心(16000g,15s)后弃上清，加230uldna裂解液重悬菌体；

②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，涡旋3min；其中，苯酚、氯仿和异戊醇的质量份数比为25:24:1；

③、离心(16000g,5min)后将水层转移到一个新的ep管中；

④、加600ul冰乙醇洗剂dna,然后将ep管放在-20℃中30min；

⑤、在4℃下离心收集dna(16000g,15min)，弃乙醇，在空气中干燥3min；

⑥、用200ulte重悬dna,加5ulrna酶后37℃孵育10min；

⑦、加5mnacl8ul和两倍体积的冰乙醇，在-20℃放置30min；离心(16000g,15min)后弃乙醇，放在空气中干燥；

⑧、用水/te重悬dna,得到酵母基因组dna；

(二)用高保真phusion酶pcr扩增得到ddi2启动子：

pcr体系的总体积50μl，其中phusion0.5μl、phusionbuffer10μl、dntpmix2μl、模板100ng、上游引物(浓度10μm)1μl、下游引物(浓度10μm)1μl、h2o补足到50μl；prc反应条件为：98℃、1min条件下进行预变，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此进行30个循环，然后在72℃、10min进行扩增，扩增得到ddi2启动子。

其中，所述引物对的序列如下：

u1:5’-tctaagataaaacacagatcgac-3’

u2:5’-gattgattcttttgaagagaagc-3’。

另外，本发明还提供了所述的酵母诱导型启动子在调控酵母基因表达中的应用：所述酵母为酿酒酵母。

其中，诱导物为氰胺。

其中，所述氰胺的浓度为5-8mm。

实施例1、启动子强度比较

一、重组表达载体的构建

1、用限制性内切酶bamhi和sphi酶切质粒ycplac111-sfgfp-his6-tcyc1，回收质粒酶切产物；

2、用phusion酶扩增启动子padh1、pgal1、pddi2；回收pcr产物；

3、分别将步骤1的载体骨架和步骤2的回收产物用quick-fusion酶连接，得到三个重组质粒(ycplac111-padh1-sfgfp-his6-tcyc1、ycplac111-pgal1-sfgfp-his6-tcyc1、ycplac111-pddi2-sfgfp-his6-tcyc1)，进行测序验证，测序结果表明，得到了三种目的质粒，如图1、图2、图3所示。

二、激光共聚焦显微镜观察荧光强度

1、将上面构建得到的三种启动子的质粒转化到酵母菌株w303中；

2、在sd-leu培养基中培养菌株(ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l，ura0.02g/l，trp0.1g/l，his0.1g/l,ade0.02g/l,lys0.1g/l,met0.1g/l,arg0.1g/l)。其中，pgal1需要在棉子糖培养基中饥饿3h(ynb6.7g/l，棉子糖10g/l，ura0.02g/l，trp0.1g/l，his0.1g/l,ade0.02g/l,lys0.1g/l,met0.1g/l,arg0.1g/l),后在半乳糖培养基中诱导3h(ynb6.7g/l，半乳糖20g/l，ura0.02g/l，trp0.1g/l，his0.1g/l,ade0.02g/l,lys0.1g/l,met0.1g/l,arg0.1g/l)；pddi2先在sd-leu中培养3h,后加5mm氰胺诱导3h；padh1在sd-leu培养基中培养6h；

3、分别取1od上述培养好的酵母细胞,在室温下5000rpm转速离心2min，收集细胞，用1mlpbs洗涤一次，最后用1mlpbs重悬细胞，待显微镜观察；

4、参照激光共聚焦显微镜操作方法，选用60倍油镜，激发光波长488nm，荧光强度100％，观察酵母细胞在不同启动子调控下绿色荧光激发情况。如图4所示，可以从荧光亮度大致看出ddi2启动子和gal1启动子强度差不多，且强度都大于adh1启动子。

三、流式细胞仪(facs)检测荧光表达

1、按照前面共聚焦显微镜检测的方法制备和处理样品，参照流式细胞仪荧光检测的操作方法，选用488nm激发波长，检测50000个细胞的荧光表达；

2、对于pgal1分别在不同诱导时间下(2h、3h、4h)检测其荧光表达，padh1在不同培养时间下(2h、3h、4h)检测荧光表达(如图5所示)，pddi2在4h诱导时间下用不同浓度的氰胺(0-8mm)诱导，检测其荧光表达(如图6所示)。

3、以上实验每组重复三次，取meanfluorescence值做统计图。

总结：通过三种启动子调控sfgfp表达的平均荧光强度值比较，可看出酵母诱导性启动子ddi2强度比较大，且相比于gal1启动子其培养时间节省近一半。

实施例2、western检测氰胺诱导pddi2调控sfgfp表达情况

1、将pddi2菌株在sd-leu培养基中培养3h后，加入不同浓度(0-5mm)氰胺诱导4h，同时用w303野生菌株同样培养(加5mm氰胺)做对照；

2、收集5od上述培养的菌液，按照酵母小量总蛋白的方法提蛋白。将得到的蛋白样品用于western检测(gfpantibody:1:2000)。

总结：由图6、7可知，本启动子的诱导活性随氰胺浓度增加而上升，在5-8mm浓度下有较强的活性。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

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<110>青岛百慧智业生物科技有限公司

<120>一种新型酵母诱导型启动子及其应用

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