一种植物盐/干旱诱导型启动子soyEQ及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及盐/干旱诱导型启动子soyEQ及其应用。

背景技术：

土壤盐渍化以及水资源短缺是目前制约农业生产的全球性问题，全球20％的耕地受到盐害威胁，43％的耕地为干旱、半干旱地区，这两种胁迫是世界范围内造成农作物减产最主要的非生物胁迫。这两种非生物胁迫能引发植物从调节基因表达到生长速率、产量变化等一系列反应。因此，增强和改善植物对盐渍、干旱等非生物胁迫的耐受性、抵抗力一直是农业科研工作者的研究目标和热点。

植物基因工程技术是在分子水平上定向重组遗传物质，为培育植物新品种开辟了崭新的途径。在植物转基因工程研究中，除导入抗逆等相关基因，胁迫诱导型启动子无疑已成为植物抗逆研究中的有利工具。胁迫诱导型启动子在胁迫的条件下有着显著的诱导特性，可在植物特定的生长环境下，诱导特定基因的表达，以保证植物的正常生长，当胁迫解除后，特定基因则停止表达，这样不仅不会造成植物体内资源浪费，又可提高植物在胁迫条件下的抗性。如：拟南芥胁迫诱导型启动子rd29A驱动AtDREB1A/CBF3基因转化到高羊茅中，缺水处理30天后，非转基因植株全部萎蔫，而转基因植株只有少部分萎蔫；苋属植物AmCMO基因上游-410bp启动子片段含有盐胁迫响应序列，300mmol/LNaCl处理24小时后，下游报告基因GUS活性显著提高。

根据诱导条件不同，胁迫诱导型启动子主要分为盐诱导型启动子，干旱诱导型启动子，植物激素诱导型启动子，低温诱导型启动子，高温诱导型启动子等。利用盐诱导型启动子、干旱诱导型启动子驱动抗逆基因表达，可使抗逆转基因植物更好的适应环境，从而解决盐渍、干旱带来的农业问题。因此，获得新的有效的盐诱导型启动子，或干旱诱导型启动子，或兼具盐/干旱诱导型启动子特性的启动子，将广泛应用在植物抗逆育种研究中。

技术实现要素：

本发明提供一种大豆盐/干旱诱导型启动子soyEQ，该诱导型启动子soyEQ包含序列表Seq ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明的一种植物盐/干旱诱导型启动子soyEQ，它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

本发明的一种植物盐/干旱诱导型启动子soyEQ的应用，它用于提高植物的抗逆性。

本发明所述的植物盐/干旱诱导型启动子soyEQ所表达的是既有盐诱导型，又有干旱诱导型的启动子soyEQ。

本发明提供的soyEQ启动子可以在盐、干旱胁迫条件下，启动下游基因在植物中高表达。因此该启动子soyEQ可以用于提高和改善植物在盐胁迫、干旱胁迫下的生长状况及环境适应性，从而有效提高植物的抗逆性。经GUS基因转录水平和GUS蛋白活性分析表明，在盐胁迫和干旱胁迫下，soyEQ启动子诱导活性分别能够达到CaMV35S启动子的2.1倍和3.3倍，说明soyEQ是一种新的高效的盐/干旱诱导型启动子。

附图说明

图1为Em基因在盐条件下大豆中的表达量图；

图2为Em基因在干旱条件下大豆中的表达量图；

图3为本发明soyEQ启动子的扩增产物电泳图；其中，M：2000bp DNAmarker；1：PCR产物；

图4为重组质粒pMD18-T-soyEQ的双酶切鉴定电泳图；其中，M：2000bp DNAmarker；1：重组质粒pMD18-T-soyEQ的双酶切结果；

图5为重组质粒pCAM-soyEQ的双酶切鉴定电泳图；其中，M：2000bp DNAmarker；1和2分别为:重组质粒pCAM-soyEQ的双酶切结果；

图6为在盐条件下qRT-PCR检测GUS基因在转pCAM-soyEQ基因烟草中的表达量图；

图7为在干旱条件下qRT-PCR检测GUS基因在转pCAM-soyEQ基因烟草中的表达量图；

图8为在盐胁迫24h下荧光分光光度法测定转pCAM-soyEQ基因烟草中GUS活性图；其中，A为对照(未处理)柱状图，B为在盐胁迫24h下转pCAM-soyEQ基因烟草中GUS活性柱状图；C为在盐胁迫24h下转pCAMBIA1301烟草植株中GUS活性柱状图；D为在盐胁迫24h下野生型烟草中GUS活性柱状图；WT:野生型烟草；CaMV35S:GUS基因由CaMV35S启动子驱动；soyEQ:GUS基因由soyEQ启动子驱动；

图9为在干旱条件10h下荧光分光光度法测定转pCAM-soyEQ基因烟草中GUS活性图；其中，A为对照(未处理)柱状图，B为在干旱条件10h下转pCAM-soyEQ基因烟草中GUS活性柱状图；C为在干旱条件10h下转pCAMBIA1301烟草植株中GUS活性柱状图；D为在干旱条件10h下野生型烟草中GUS活性柱状图；WT:野生型烟草；CaMV35S:GUS基因由CaMV35S启动子驱动；soyEQ:GUS基因由soyEQ启动子驱动；

图10为组织化学染色检测图；其中，A为盐胁迫24h；B为干旱胁迫10h；WT:野生型烟草；CaMV35S:GUS基因由CaMV35S启动子驱动的组织化学染色图片；soyEQ:GUS基因由soyEQ启动子驱动的组织化学染色图片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种植物盐/干旱诱导型启动子soyEQ，它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

具体实施方式二：本实施方式的一种植物盐/干旱诱导型启动子soyEQ的应用，它用于提高植物的抗逆性。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：该启动子soyEQ用于提高植物的耐盐胁迫性，抗干旱性。其它与具体实施方式二相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

1、大豆Em基因在盐/干旱条件下大豆中的表达

1.1 大豆材料处理及RNA提取

大豆品种为吉豆2号，逆境条件下材料处理：将大豆水培幼苗分别置于含有NaCl(200mmol/L)和PEG8000(20％)的Hoaglands营养液中进行盐和干旱胁迫处理。在处理0小时(h)、1h、2h、5h、10h、24h时分别取样，迅速放于液氮中，置-80℃中保存备用。

1.2 qRT-PCR检测Em基因在大豆植株中表达

根据RNA提取试剂盒步骤，提取大豆各种备用材料的总RNA；以总RNA为模板，按照逆转录的步骤分别合成cDNA的第一条链，进行qRT-PCR反应。以大豆持家基因β-tubulin(GMU12286)为内参，内参引物分别为(T₁:5’-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3’；T₂:5’-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3’)。根据NCBI中大豆Em基因的核苷酸序列(AF004805)，利用Primer Premier 5.0软件设计检测该基因的引物，上游引物(QF:5’-ATGGCATCTCGTCA AAACAAC-3’)和下游引物(QR:5’-GTCTTCGTTCTGATTCTGGTTCTTG-3’)。利用BIO-RAD CFX96实时定量PCR仪，反应循环参数为：95℃10s，59℃20s，72℃30s。每次取样点设3次技术重复，实验共设3次生物学重复；结果见图1，大豆Em基因在盐胁迫下，随着处理时间的延长，表达量逐渐升高，当处理24h，相对于未处理的对照，表达量约为82.8。结果见图2，在干旱胁迫下，随着处理时间的延长，Em基因表达量逐渐升高，最大值为处理10h，相对于未处理的对照，表达量约为74.5，之后相对表达量下降。说明Em基因在大豆植物中，受盐、干旱诱导，诱导表达上升。

2.大豆盐/干旱诱导型启动子soyEQ的克隆

以大豆叶片为材料，采用CTAB法提取大豆的基因组DNA。根据大豆Em基因的核苷酸序列(AF004805)，在大豆基因组序列(http://www.phytozome.net/soybean)中搜索该基因5’端上游序列。以基因组DNA为模板，设计含有PstI酶切位点的上游引物和含有NcoI酶切位点的下游引物，分别为AE(5’-GGGCTGCAGGATTGATGAAGGAGTGAC AGAA-3’)和RE(5’-GGGCCATGGGTTTCTCACACTTGCAAAATTC-3’)，扩增大豆Em基因ATG上游序列。PCR反应条件为预变性95℃5min；94℃30s，55℃40s，72℃1min，共30个循环；72℃后延伸7min。PCR扩增获得长度为1997bp的序列，命名为soyEQ(图3为该基因的电泳结果)。将PCR扩增片段连接到pMD18-T克隆载体上，获得重组质粒pMD18-T-soyEQ，双酶切鉴定(电泳结果如图4所示)，并进行测序。测序结果如序列Seq ID No：1所示的核苷酸序列，该序列与大豆基因组中相对应序列的同源性为99.25％，说明已获得Em基因上游启动子序列，个别碱基的差异可能与品种间差异有关。

3.soyEQ启动子的序列分析

利用在线启动子分析软件Neural Network Promoter Prediction和softberry网站(http://www.softberry.com)中的TSSP，并结合真核细胞基因启动子的基本特征，推测可能的转录起始位点1902bp处的G。用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)分析启动子序列中存在的顺式作用元件和转录因子的结合位点，表明该序列中含有多种在其他植物启动子中存在的通用启动子元件TATA盒(1871-1879bp)，及多个典型的逆境胁迫相关元件，如：应答逆境胁迫反应及抵抗病原菌侵害的MYB转录因子结合位点元件Myb core(CNGTTR)3个；调控植物防御基因表达的DOF转录因子结合位点元件AAAG有7个；存在于植物防御反应相关启动子中的元件W-box(TTGAC)(WRKY-type转录因子结合位点)4个；响应干旱和低温的元件Evening element(ATATCT)2个；ABA响应元件(ABREs)(PyACGTGG/TC)2个，ABA是一种重要的植物激素，在植物对胁迫耐受性和抗性中发挥重要作用。

4.构建表达载体及转化

用PstI和NcoI双酶切重组质粒pMD18-T-soyEQ，回收克隆片段，与PstI和NcoI双酶切pCAMBIA1301质粒载体得到的大片段进行连接，经转化和酶切验证，构建得到植物表达载体pCAM-soyEQ。将重组质粒pCAM-soyEQ用PstI和NcoI双酶切进行鉴定，获得与预期大小一致的目的片段(图5为该片段的电泳结果)，说明soyEQ启动子片段替换了pCAMBIA1301中的组成型启动子CaMV35S，证明该植物表达载体构建正确。通过冻融法，将pCAM-soyEQ和pCAMBIA1301载体质粒转化至农杆菌EHA105中。

5.转基因烟草的筛选及分子鉴定

通过叶盘法，侵染无菌苗烟草叶片，在含有5mg/L潮霉素的MS培养基上进行培养。待生根后转移土壤中继续生长。利用PCR法和RT-PCR法进行检测，获得阳性转烟草植株。用AE和GR(5’-CCCACACTTTGCCGTAATGAG-3’)作为PCR检测转pCAM-soyEQ烟草植株的引物，用GF(5’-AGGACCTAACAGAACTCGCCGTAA-3’)和GR作为PCR检测转pCAMBIA1301烟草植株的引物。ZF(5’-TTCTACACAGCCATCGGTCCA-3’)和ZR(5’-TGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3’)作为RT-PCR检测阳性转基因植株引物。继续筛选得到T₁代阳性转基因烟草植株。

6.qRT-PCR检测GUS基因在转pCAM-soyEQ基因烟草中表达

在盐、干旱胁迫下，转pCAM-soyEQ烟草植株中GUS基因的转录水平，能够体现soyEQ启动子调控下游基因的转录水平。材料逆境处理、RNA提取、逆转录步骤，与qRT-PCR检测Em基因在大豆植株中表达的步骤相同。进行qRT-PCR反应时，以烟草持家基因a-tubulin为内参，内参引物分别为(PF:5’-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3’；PR:5’-TTCACTGAAG AAGGTGTTGAA-3’)。引物(KF:5’-GATCGCGAAAACTGTGGAAT-3’；KR:5’-TAATGAGTGACCGCATCGAA-3’)作为检测GUS基因的引物。同样利用BIO-RAD CFX96实时定量PCR仪，反应循环参数为：95℃10s，54℃20s，72℃30s。每次取样点设3次技术重复，实验共设3次生物学重复。在阳性转pCAM-soyEQ烟草植株中，盐胁迫和干旱胁迫下，soyEQ驱动GUS基因的表达趋势同Em基因在大豆中盐、干旱胁迫下的表达趋势相似。如图6所示，在盐胁迫下，随着处理时间的延长，表达量逐渐升高，当处理24h，相对于对照(未处理的转基因植株)，表达量约为66.4。如图7所示，在干旱胁迫下，随着处理时间的延长，表达量逐渐升高，最大值为处理10h，相对于对照(未处理的转基因植株)，表达量约为86.1，之后相对表达量下降。从GUS基因的转录水平，显示出soyEQ启动子受盐、干旱诱导，能够调控下游基因在盐、干旱条件下，表达显著升高。

7.GUS活性分析

根据qRT-PCR检测结果，转pCAM-soyEQ基因的烟草植株，在盐胁迫和干旱胁迫分别是24h和10h时，GUS基因的转录水平最高。继续利用荧光分光光度计进行GUS活性分析，用液氮将样品研磨成粉末，加提取缓冲液(100mL中加入：50mmol/L磷酸钠缓冲液pH＝7.050mL，β-巯基乙醇100μL，0.5mmol/L EDTA 2mL，10％SDS 1mL，100μL TritonX 100)，12000rpm 4℃离心10分钟，取上清液得到GUS可溶性蛋白粗体液。取出部分加1mmol/L的GUS反应底物4-MUG，37℃保温20分钟，加0.2mmol/L的Na₂CO₃反应终止液终止反应。可溶性蛋白含量的测定采用Bradford法。以1分钟水解4-MUG生成1nmol/L 4-MU所需酶量为一个酶活力单位，以每毫克蛋白的酶活力表示GUS活性，上述实验重复三次。结果如图8所示，在盐胁迫下24h时，转pCAM-soyEQ基因烟草植株中，soyEQ驱动的GUS活性约为175.1nmol/LMU/mg，是未处理转pCAM-soyEQ基因植株的51.5倍，是转pCAMBIA1301烟草植株(CaMV35S启动子驱动的GUS活性)的2.1倍；如图9所示，在干旱胁迫下10h时，转pCAM-soyEQ基因烟草植株中，soyEQ驱动的GUS活性约为268.6nmol/LMU/mg，是未处理转pCAM-soyEQ基因植株的79倍，是转pCAMBIA1301烟草植株(CaMV35S启动子驱动的GUS活性)的3.3倍。

此外，进行GUS组织化学染色分析，将处理后的烟草叶片放入GUS染色液中(50mmol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)，0.5mmol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.5mmol/L K₄[Fe(CN)₆]，10mmol/L EDTA，0.1％Triton X-100和2mmol/LX-gluc)，37℃染色12h，之后材料先后用50％、75％、100％乙醇漂洗，至完全脱色。肉眼下观察，并拍照。如图10所示，在盐胁迫24h和干旱胁迫10h时，野生型烟草叶片均未染色，转CaMV35S启动子的烟草叶片都染成蓝色，说明该载体中的GUS报告基因能够被CaMV35S组成型启动子激活表达。转soyEQ启动子的烟草叶片在盐胁迫24h和干旱胁迫10h时，都染成较转CaMV35S启动子烟草叶片更深的蓝色，尤其在干旱胁迫10h时。

以上GUS基因转录水平和GUS蛋白活性分析结果，说明soyEQ启动子受盐和干旱诱导，且诱导活性分别能够达到CaMV35S启动子的2.1倍和3.3倍，说明soyEQ是一种新的高效的盐/干旱诱导型启动子。