可诱导的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干细胞及其应用的制作方法

本发明涉及基因表达调控领域，特别涉及一种可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞及其应用。
背景技术：
：rna干扰(rnai)或者基因过表达(overexpression，oe)是基因功能研究的常用方法。然而，rnai是一种转录后调控，并且容易出现脱靶的现象；过表达(oe)往往利用克隆载体启动子促进外源基因的表达，在不同细胞类型中启动子的活性不稳定、不可控。规律成簇的间隔短回文重复crispr与内切酶cas9的组合，可以在引导rna(sgrna)的指引下，靶标并切割入侵者的dna遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将crispr系统制成了强大的基因组编辑工具(jinek,m.等人，2012；cong,l.等人，2013)。但是传统的crispr/cas9方法对基因的编辑可能造成在细胞基因组中预期之外的插入或删除等。进一步的研究发现，cas9两个氨基酸点突变会导致酶活性丧失，称之为dcas9。如果dcas9连接转录辅因子，在引导rna(sgrna)的指引下，无需切割dna就可以有效地进行dna序列特异性的调控。比如，如果dcas9串联转录抑制辅因子如krab，则可以实现转录抑制(crispri)；如果dcas9串联转录激活辅因子如vp64，则可以实现转录激活(crispron或者crispractivation)(dominguez,a.a.等人，2016)。利用这一方法，可以动态操纵绝大多数基因的转录。但该方法借助于转座酶系统的随机插入，可能会引起意外的基因组变化。技术实现要素：为解决上述问题，本发明实施例公开了一种可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞。技术方案如下：一种可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞，其中小鼠胚胎干细胞是a2lox.cre细胞，其可逆地表达dcas9-vpr融合蛋白或dcas9-krab融合蛋白。在本发明的上下文中术语“a2lox.cre细胞”是指，在小鼠胚胎干细胞系e14的rosa26位点整合表达rtta，所获得的阳性克隆按编号命名为a17。在a17的小鼠胚胎干细胞中的组成性表达的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因的5'端整合插入tre-loxp-cre-loxp-δneo序列，所得的阳性克隆命名a2lox.cre(iacovino,m.等人，2011)。tre即四环素应答元件，rtta与之结合后抑制下游基因转录，加入强力霉素(doxycline，简称dox)或者四环素的情况下则使rtta改变构象而激活下游基因转录。cre重组酶是细菌噬菌体p1的i型拓扑异构酶，被诱导表达以后可以催化loxp位点间的dna进行位点特异性重组。δneo是缺少启动子和起始密码子的新霉素neomycin编码基因(neo)，因此neo无法表达，此时该细胞不具备g418抗性。在本发明的上下文中术语“dcas9-vpr”是指，三个已知的转录激活蛋白vp64-p65-rta(vpr)串联后与无活性的dcas9的融合蛋白。通常斜体“dcas9-vpr”表示编码这三个转录激活蛋白的与无活性dcas9的融合蛋白的核酸。在本发明的上下文中术语“dcas9-krab”是指，已知的转录抑制蛋白krab与无活性的dcas9的融合蛋白。通常斜体“dcas9-krab”表示编码转录抑制蛋白krab的与无活性dcas9的融合蛋白的核酸。在本发明的一个具体实施方案中，a2lox.cre细胞的基因组整合了dcas9-vpr基因或dcas9-krab基因。在本发明的另一个具体实施方案中，dcas9-vpr基因或所述dcas9-krab基因被整合到所述a2lox.cre细胞基因组中hprt基因的5'端。本发明还提供了可诱导的crispron或crispri小鼠胚胎干细胞的制备方法，其包括以下步骤：(1)分别以dcas9-vpr和dcas9-krab表达载体(addgene#63800和#50917)为模板进行pcr扩增dcas9-vpr基因或dcas9-krab基因，并构建到含有loxp位点的载体上，得到构建体质粒；(2)在a2lox.cre细胞中加入强力霉素，诱导后，分别转染步骤(1)中得到的构建体质粒，再加强力霉素诱导；诱导完成后，加入g418进行筛选；(3)将步骤(2)筛选得到的细胞扩增后加入强力霉素诱导，诱导后，筛选出可诱导的crispron或crispri小鼠胚胎干细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，步骤(1)中，pcr扩增dcas9-vpr基因或dcas9-krab基因，并构建到pcr-entry载体(购自于invitrogen公司)上，然后通过lr反应(invitrogentmgatewaytm克隆系统)同源重组到含有loxp位点的p2lox-flag载体(mazzoni,e.o.等人，2010)上，得到构建体质粒p2lox-flag-dcas9-vpr或p2lox-flag-dcas9-krab。在本发明的上下文中术语“lr反应”属于gatewaytm技术，gatewaytm技术是克隆和亚克隆dna序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，dna片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。gatewaytm技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统(attbxattp→attlxattr)。bp和lr两个反应就构成了gatewaytm技术。bp反应利用一个attbdna片段或表达克隆和一个attp供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。lr反应是一个attl入门克隆和一个attr目的载体之间的重组反应。lr反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。本发明还提供了一种调控基因表达的方法，其包括(1)设计靶向目的基因的sgrna序列；(2)将sgrna克隆到plx-sgrna载体；(3)包装慢病毒；(4)用携带有sgrna的慢病毒感染所述的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，其中sgrna靶向目的基因的调控序列，所述目的基因的调控序列优选为启动子或增强子。在本发明的另一个优选的实施方案中，其中通过改变强力霉素的浓度来调控基因表达水平。在本发明的另一个优选的实施方案中，强力霉素的浓度优选为0-1000ng/ml。本发明还提供了一种调控基因表达的试剂盒，其包含可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞和/或靶向目的基因的sgrna。本发明还提供了一种功能基因的筛选方法，其包括设计并合成sgrna文库，利用所述sgrna文库在所述的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞或者其特定的分化细胞类型中进行基因筛选，确定各sgrna所对应基因的功能。本发明提供的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞在a2lox.cre细胞基础上构建，同源重组效率高，得到的稳定克隆阳性率高达90％以上。本发明提供的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞实现了定点整合，dcas9-krab和dcas9-vpr整合到hprt基因的5'端，在管家基因的位置上表达稳定、效率高，并且不同于以往的转座酶系统的随机插入，不会引起意外的基因组变化。本发明首次在小鼠胚胎干细胞中实现了定点整合的可诱导体系。传统crispr/cas9方法对基因的编辑可能造成在细胞基因组中预期之外的插入或删除等，而本发明提供的基因表达调控的方法不编辑基因组序列，直接激活或者抑制基因表达。相对于基因功能研究中常用的基因过表达和rnai，本发明提供的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞对目的基因特异性的激活或者抑制是一种内源性的转录调控。本发明提供的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞中实现了融合蛋白可诱导和可逆地表达。根据改变强力霉素浓度，可以灵活控制dcas9融合蛋白的表达量和不同程度的转录激活或者抑制。本发明提供的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞可以待细胞分化到特定阶段加入强力霉素而实现特定时期的转录调控。通过靶向基因调控区不同区段的特异sgrna，也可以不同程度地开启或关闭基因表达。本发明提供的可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞可以通过特异sgrna的靶向作用，研究潜在dna调控序列比如启动子、增强子等转录调控功能。并且短时间的诱导可以实现在细胞命运不发生改变的情况下的转录调控，避免了细胞命运改变而继发的不必要的干扰。在本发明的上下文中“rt-qpcr”是指实时荧光定量pcr，就是通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量pcr反应中，引入了一种荧光化学物质，随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。当然，实施本发明的任一产品或方法必不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1显示了crispron和crispri小鼠胚胎干细胞基因组构建的示意图；图2显示了dcas9-vpr基因和dcas9-krab基因整合进小鼠胚胎干细胞a2lox.cre基因组的验证结果；图3显示了强力霉素可逆地诱导dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表达；图4a和4b显示了不同浓度的强力霉素不同程度地诱导dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表达；图4c显示了随着强力霉素浓度的增加，nkx2.5基因的mrna表达水平增加。图5显示了选取靶向基因启动子的特异sgrna，强力霉素诱导相应基因不同程度的转录激活或者抑制效应；图6显示了靶向特异基因增强子(近端增强子pe或者远端增强子de)的sgrnas，强力霉素诱导相应基因不同程度的转录激活或者抑制效应。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1可诱导的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞的制备分别以dcas9-vpr和dcas9-krab表达载体(addgene#63800和#50917)为模板进行pcr。pcr反应引物参见表1。表1pcr引物引物名称序列(5’-3’)seqidno.dcas9-vpr上游引物atggacaagaagtactccattgg1dcas9-vpr下游引物ttaaaacaaacttgtgtcaaata2dcas9-krab上游引物atggacaagaagtactccattgg3dcas9-krab下游引物ttataccagccaaggttcttccc4pcr反应体系：加入10μleasytaq酶72℃延伸20min。将上述两个pcr片段分别构建到pcr8-entry载体(invitrogen)上，然后通过lr反应(invitrogentmgatewaytm克隆系统)同源重组到含有loxp位点的p2lox-flag载体(mazzoni,e.o.等人，2010)上，得到的构建体质粒分别命名为p2lox-flag-dcas9-vpr和p2lox-flag-dcas9-krab。在a2lox.cre细胞中加入500ng/ml终浓度的强力霉素，诱导24小时后分别转染质粒p2lox-flag-dcas9-vpr或p2lox-flag-dcas9-krab，再加入500ng/ml终浓度的强力霉素诱导24小时。表达的cre酶对loxp位点进行同源重组，将转入质粒的基因组片段整合到tre启动子的下游；同时把质粒中pgk启动子和起始密码atg整合到了δneo上游，使neo基因得以表达，细胞因而获得g418抗性。转染24小时后加入g418(300μg/ml)进行筛选。图1示出了本发明的crispron和crispri小鼠胚胎干细胞基因组构建的示意图。通过pcr进行基因组验证，pcr反应引物参见表2。表2基因组验证所用的pcr引物引物名称序列(5’-3’)seqidno.dcas9基因组验证上游引物ttaccactccctatcagtgatag5dcas9基因组验证下游引物aggaagctctcttccagcctatg6基因组验证所用的pcr反应体系：基因组验证pcr反应条件：验证结果见图2，该结果验证了dcas9-vpr和dcas9-krab分别插入到tre序列的下游，a2.lox.cre为阴性对照，a2lox.cre-crispron为dcas9-vpr和tre序列pcr的结果，a2.lox.cre-crispri为dcas9-krab和tre序列pcr的结果。测序结果同样验证了克隆的正确性。dcas9-vpr基因的序列如seqidno.7所示，dcas9-krab基因的序列如seqidno.8所示。对筛选所得的单克隆细胞，分别进行细胞增殖，然后加入500ng/ml终浓度的强力霉素诱导，通过常规的westernblot法检测dcas9-vpr或者dcas9-krab融合蛋白的表达，诱导后稳定表达的即为阳性小鼠胚胎干细胞克隆，分别命名为tre-dcas9-vpr和tre-dcas9-krab，然后进行细胞增殖以备用。westernblot法是本领域的常规技术，具体步骤可以参见例如《分子克隆实验指南(第三版)》，在此不做赘述。实施例2dcas9-vpr或dcas9-krab融合蛋白表达的可诱导性和可逆性将实施例1获得的小鼠胚胎干细胞克隆tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab在小鼠胚胎干细胞培养基(gmem培基，15％胎牛血清，0.1mmβ-巯基乙醇，2mm谷氨酰胺，0.1mm非必需氨基酸，1％青霉素/链霉素，1mm丙酮酸钠，5ng/mllif(白血病抑制因子)，小鼠胚胎干细胞所用的培养皿要用0.1％的明胶提前包被)中培养，加入500ng/ml终浓度的强力霉素，培养24小时后撤出强力霉素，换上不含强力霉素的小鼠胚胎干细胞培养基再分别培养24、48、72小时；以β-肌动蛋白作为内参。用westernblot法检测dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表达量，结果如图3所示，dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白在加入强力霉素的10小时左右即开始表达，并且在强力霉素存在的情况下会持续表达；撤去强力霉素48小时以后融合蛋白就会消失。采用一系列梯度浓度(20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)的强力霉素，将实施例1获得的小鼠胚胎干细胞克隆tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab处理12小时后收获细胞，用westernblot法检测dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表达量，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为内参，结果如图4a和4b所示，不同浓度的强力霉素不同程度地诱导dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表达。实施例3通过靶向基因的sgrna调控目的基因表达(1)根据转录起始位点附近的序列设计靶向nkx2.5的sgrna，其序列为seqidno.5：cgggcggcgggcaccatgcg。sgrna的设计方法是本领域的常规技术，本领域技术人员也可以选择sgrna设计软件或在线设计(如http://www.e-crisp.org/e-crisp/，http://crispr.mit.edu/等)来设计相应的sgrna，在此不做赘述。将该sgrna克隆到plx-sgrna载体(addgene#50662)，包装慢病毒，感染实施例一制备的tre-dcas9-vpr和tre-dcas9-krab细胞，两天后加入blasticidin(4μg/ml)进行筛选。筛选4-6天后存活的细胞中加入500ng/ml终浓度的强力霉素，孵育48小时后通过rt-qpcr检测相应目的基因相对于不诱导细胞的nkx2.5的mrna表达水平变化。rt-qpcr是本领域的常规技术，在此不做赘述。由图4c可知，随着强力霉素浓度的增加，nkx2.5基因的mrna表达水平增加。实施例4通过靶向基因启动子的sgrna调控目的基因表达设计靶向基因nkx2.5、oct4和kdm2b启动子的sgrna：nkx2.5-sgrna#1、nkx2.5-sgrna#2、oct4-sgrna#1、oct4-sgrna#2、kdm2b-sgrna#1、kdm2b-sgrna#2，这些sgrna的序列参见表3。表3一些靶向基因启动子的sgrna的序列将表3中示出的sgrna分别克隆到plx-sgrna载体，包装慢病毒，分别感染实施例1制备的tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab小鼠胚胎干细胞，两天后加入杀稻瘟菌素(4μg/ml)进行筛选。筛选4-6天后存活的细胞中加入500ng/ml终浓度的强力霉素，孵育48小时后通过rt-qpcr检测相应目的基因相对于不诱导细胞的nkx2.5的mrna表达水平变化。图5分别示出了加入强力霉素前后nkx2.5、oct4、kdm2b三种基因转录水平的变化，可见dcas9-vpr融合蛋白激活nkx2.5基因的转录起始区诱导基因转录上调，dcas9-krab抑制oct4、kdm2b基因的转录起始区诱导基因转录下调。实施例5通过靶向基因增强子的sgrna调控目的基因表达设计靶向特异基因增强子即近端增强子pe和远端增强子de的sgrna：nkx2.5pe-sgrna#1、nkx2.5pe-sgrna#2、sox2de-sgrna#1、sox2de-sgrna#2，这些sgrna的序列参见表4。表4一些靶向特异基因增强子的sgrna的序列sgrna序列名称序列(5’-3’)seqidno.nkx2.5pe-sgrna#1ggttcgggcagtgactcttg15nkx2.5pe-sgrna#2cgccgcaccatctttttctt16sox2de-sgrna#1acccaacgtacatgtttttg17sox2de-sgrna#2gctataaagtcacctggtgc18将表4中示出的sgrna分别克隆到plx-sgrna载体，包装慢病毒，分别感染实施例1制备的tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab小鼠胚胎干细胞，两天后加入杀稻瘟菌素(4μg/ml)进行筛选。筛选4-6天后存活的细胞中加入500ng/ml终浓度的强力霉素，孵育48小时后通过rt-qpcr检测相应目的基因相对于不诱导细胞的nkx2.5的mrna表达水平变化。图6分别示出了加入强力霉素前后nkx2.5、sox2两种基因转录水平的变化，可见融合蛋白dcas9-vpr激活nkx2.5近端增强子区诱导基因转录上调，融合蛋白dcas9-krab抑制sox2远端增强子区诱导基因转录下调。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。参考文献1.jinek,m.,etal.,aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.science,2012.337(6096):p.816-21.2.cong,l.,etal.,multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science,2013.339(6121):p.819-23.3.dominguez,a.a.,w.a.lim,andl.s.qi,beyondediting:repurposingcrispr-cas9forprecisiongenomeregulationandinterrogation.natrevmolcellbiol,2016.17(1):p.5-15.4.iacovino,m.,etal.,induciblecassetteexchange:arapidandefficientsystemenablingconditionalgeneexpressioninembryonicstemandprimarycells.stemcells,2011.29(10):p.1580-8.5.mazzoni,e.o.,etal.,embryonicstemcell-basedmappingofdevelopmentaltranscriptionalprograms.natmethods,2011.8(12):p.1056-8.序列表<110>天津医科大学<120>可诱导的crispron或crispri小鼠胚胎干细胞及其应用<130>pp170468<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-vpr上游引物<400>1atggacaagaagtactccattgg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-vpr下游引物<400>2ttaaaacaaacttgtgtcaaata23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-krab上游引物<400>3atggacaagaagtactccattgg23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-krab下游引物<400>4ttataccagccaaggttcttccc23<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9基因组验证上游引物<400>5ttaccactccctatcagtgatag23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9基因组验证下游引物<400>6aggaagctctcttccagcctatg23<210>7<211>5700<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-vpr基因<400>7atggacaagaagtactccattggcctcgccatcggaacaaatagcgtgggctgggctgtc60atcacagatgagtacaaggtgcctagcaagaaatttaaggtgctgggaaatacagacaga120catagcatcaagaagaacctcattggcgctctcctgtttgactccggcgaaacagccgaa180gctaccagactcaagagaaccgctaggagaaggtacaccagaaggaaaaacaggatttgc240tacctgcaggaaattttttccaacgagatggccaaggtggacgattccttcttccatagg300ctggaagagagcttcctcgtggaggaagacaagaaacacgagaggcatcctatttttggc360aatattgtggatgaggtcgcctaccatgagaagtatcccacaatctatcatctgagaaaa420aaactggtggatagcaccgacaaggccgatctcaggctcatttatctcgctctggctcac480atgatcaagtttaggggccacttcctgatcgaaggcgacctgaatcccgacaactccgac540gtggacaaactgttcatccagctcgtccagacctacaatcaactcttcgaggagaacccc600atcaatgct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