专利名称：天花粉蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘疾病模型的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及天花粉蛋白在制备小鼠 过敏性哮喘模型中的用途，以及一种由天花粉蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘疾病模 型。
背景技术：
在过去的二十年中，像哮喘等过敏性疾病呈稳定的上升趋势。这不仅影响 人们的生活质量，特别是幼儿哮喘，直接影响了儿童身体的正常发育，还对国 家经济的发展造成一定阻碍作用。虽然目前国内外对过敏性哮喘的研究日益加 深，但是针对过敏性哮喘的有效的特异性治疗手段却相对甚少。现在国际上通 用的过敏性哮喘动物模型只有鸡卵清白蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘模型。由于 0VA并不是一个在人体引发疾病的过敏原，通过此模型所获得的研究结果，并 不能很好地反映人体内哮喘的病理状态。因此，建立一种能模拟人体哮喘病理 状态的动物模型，可用于抗过敏药物的筛选以及研究哮喘的发病机制有重要的 科学意义和潜在的临床应用价值。
过敏性哮喘是一类肺部的慢性炎症疾病，它的主要特征有血清中IgE水平 升高，肺部嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润，黏液分泌过多，呼吸道非特异性反 应增强。过敏性哮喘的发病机理可以简单地概括为机体在呼吸道接触到某种 过敏原而发生免疫反应产生针对该过敏原的特异性IgE类抗体，并且这些抗体 通过受体结合于肥大细胞表面；当机体再次遇到相同过敏原时，该过敏原就能 和特异性的IgE结合，从而使肥大细胞表面的IgE发生桥联，引起了肥大细胞 的脱颗粒作用，释放白三烯，组胺等介质，招募炎症细胞浸润到肺组织，导致 平滑肌收縮，血管扩张，气管阻塞，肺部炎症发生。从免疫学的层面上来讲， 过敏性哮喘是一个典型的Th2反应。CD4阳性的辅助性T细胞通过其表面的受 体TCR识别过敏原，并释放白细胞介素，趋化因子等细胞因子，表达一些共刺 激因子，Th2细胞释放的Th2类型的细胞因子IL-4和共刺激因子CD40L能够传 递给B细胞进行抗体重链转换的信号，从而使B细胞分泌IgE类抗体；它分泌的IL-4, IL-10可以调节肥大细胞的功能，同时IL-5又是嗜酸性粒细胞浸润
和发挥功能必不可少的因素。
Th2细胞介导的Th2反应是过敏性哮喘的免疫学基础，树突状细胞 (dendritic cell, DC)决定了幼稚型T细胞向Thl或Th2的方向分化，在机体 接触到抗原的早期阶段就决定了随后所发生的免疫反应呢。树突状细胞是由骨 髓造血干细胞分化而来的一类专职抗原递呈细胞，它分为几种不同的亚型，分 布于血液，皮肤，黏膜以及各脏器中，在机体的外周起到监视作用，可以吞噬 外来病原体，是免疫系统的第一道防线。循环于外周的DC处在不成熟状态， 有很强的吞噬能力，当机体感染了微生物或是蛋白等病原体，DC就会吞噬这些 抗原，并把抗原进行加工，呈递给存在于二级引流淋巴器官的抗原特异性的T 细胞。在负载抗原的DC向淋巴结迁移的过程中，DC逐渐成熟，上调一些细胞 因子和共刺激因子以及MCHII。当它把抗原递呈给T细胞的同时，幼稚型的T 细胞就能被激活，在不同的信号作用下，向Thl或Th2方向分化。这样，DC的 不同亚型，和它接受到来自抗原的不同信号及其不同的成熟状态控制了免疫反 应的类型。
近年来，阐述DC和过敏性哮喘之间直接或间接关系的论证越来越多。有 报道强调DC不仅在哮喘的致敏阶段起启动性作用，而且在呼吸道慢性炎症的 发生和维持也至关重要。用抗原(OVA)在体外刺激过的DC来致敏小鼠，然后进 行抗原的呼吸道攻击，可以引发实验动物的过敏性哮喘症状。该实验证明了DC 在哮喘发病中的重要性。然而，尽管现在DC诱导Thl或Th2反应的三信号学 说己基本得到公认，即MHCII-TCR途径；共刺激因子途径；细胞因子-受体途 径，但是就某种过敏原所活化的信号通路，从而导致哪些关键性分子发挥作用， 本领域并不很清楚，其具体机制仍需更加系统深入的研究。
除了以上这种经典的Th细胞的分化激活方式，近些年的科学研究表明， Th2细胞发育所需要的IL-4来源于先天性免疫细胞，比如嗜碱性粒细胞，因为 Th2早期并不能够分泌足够量的IL-4。另外，对于过敏性哮喘，它的发生也不 仅仅依赖于Th2产生的IL-4， IL-5以及IL-13等细胞因子，还要依赖于其它 细胞来源的这些和其它细胞因子的表达，比如NKT细胞来源的IL-4和IL-13 对哮喘的发生是必不可少的，还有报道表明，A1(0H)3发挥佐剂的作用也是通过 活化脾脏当中Gr. r的一群细胞以依赖于IL-4的方式激活B细胞来完成的。换 句话说，体内还存在非Th2细胞来给造成一个Th2类型免疫反应发生的环境。综上，建立典型的模拟人体过敏性哮喘的模型是对于深入研究致敏机制以 及筛选抗过敏药物是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天花粉蛋白(TCS)的用途，用于制备哺乳动物 过敏性哮喘模型。
本发明的另一目的在于提供一种由天花粉蛋白诱导的哺乳动物过敏性哮 喘模型及其用途。
在本发明的第一方面，提供一种天花粉蛋白(TCS)的用途，用于制备诱导 非人哺乳动物发生过敏性哮喘的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物中不含有佐剂。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是鼠(更佳的是小鼠(mice))。
在另一优选例中，所述的组合物还用于增加非人哺乳动物肺组织或呼吸道炎 性细胞或嗜酸性粒细胞的数量；或用于增加非人哺乳动物肺组织中细胞因子 IL-4、 IL-5或IL-13的水平。
在另一优选例中，所述的组合物还用于增加非人哺乳动物血清中抗原特异性 IgE型免疫球蛋白的水平。
在本发明的第二方面，提供一种过敏性哮喘的非人哺乳动物的用途，所述的 非人哺乳动物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳动物；所述非人哺乳动物用于筛选抗 过敏性哮喘的物质。
在另一优选例中，所述由天花粉蛋白免疫非人哺乳动物的方法是先对哺乳 动物进行天花粉蛋白系统免疫(或天花粉蛋白辅助其他蛋白共同进行系统免疫)，然 后对哺乳动物进行呼吸道抗原蛋白(如天花粉蛋白)气雾攻击。
在另一优选例中，所述的系统免疫是指全身性途径免疫哺乳动物，例如采用 腹腔注射的方式。
在本发明的第三方面，提供一种筛选抗过敏性哮喘的潜在物质的方法，所 述方法包括步骤
(1)将候选物质给予过敏性哮喘的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳动物；
(2)检测动物呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细 胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平，若动物呼吸道 或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细胞因子的水平、或血清中 抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平下降，则表明该候选物质是抗过敏性哮喘 的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(l)包括在测试组中，将候选物质给予过敏性哮喘 的非人哺乳动物；和/或
步骤(2)包括检测测试组动物呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒 细胞数、炎症性细胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水 平，并与对照组比较，其中所述的对照组是不给予候选物质的过敏性哮喘的非 人哺乳动物；如果测试组中动物肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症 性细胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平在统计学上 低于(优选显著低于，如低20%;优选的低40%;更优选的低6(^或更低)对照组， 则表明该候选物质是抗过敏性哮喘的潜在物质。
在另一优选例中，所述的炎症性细胞因子包括IL-4、 IL-5或IL-13。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的动
物试验，以从潜在物质中选出对于抗过敏性哮喘有用的物质。
在另一优选例中，将候选物质给予过敏性哮喘的非人哺乳动物的方法包括但
不限于口服，或注射。
在本发明的第四方面，提供一种引发过敏性哮喘的组合物，所述的组合物含
有
有效量的鸡血清白蛋白；和 有效量的天花粉蛋白。
在另一优选例中，所述的鸡血清白蛋白和天花粉蛋白的重量比例为
1:100-100:1;优选的鸡血清白蛋白和天花粉蛋白的重量比例为1:10-10:1。 在另一优选例中，所述的组合物中还含有有效量的药学上可接受的载体。
在本发明的第五方面，提供所述的引发过敏性哮喘的组合物的用途，用于制 备诱导非人哺乳动物发生过敏性哮喘的组合物。
7本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1A显示了用TCS或0VA(含佐剂)诱导的动物模型呼吸道灌洗液中浸润的
炎性细胞总数比较。
图1B显示了用TCS或0VA(含佐剂)诱导的动物模型呼吸道灌洗液中嗜酸性 粒细胞数比较。
图lC显示了用TCS或OVA(含佐剂)诱导的动物模型的血清中抗原特异性IgE 的水平比较。
图1D显示了用TCS或0VA(含佐剂)诱导的动物模型的肺组织切片。 图1A-D中，均以采用同样的诱导处理方法，以同样体积PBS溶液+铝佐剂 处理的小鼠作为阴性对照(PBS对照组)。
图2A显示了用TCS或0VA(不含佐剂)诱导的动物模型呼吸道灌洗液中浸润 的炎性细胞总数比较。
图2B显示了用TCS或0VA(不含佐剂)诱导的动物模型呼吸道灌洗液中嗜酸 性粒细胞数比较。
图2C显示了用TCS或0VA(不含佐剂)诱导的动物模型的血清中抗原特异性 IgE的水平比较。
图2D显示了用TCS或0VA(不含佐剂)诱导的动物模型的肺组织切片。
图3A显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型呼吸道灌洗液中 细胞因子IL-4的水平。
图3B显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型呼吸道灌洗液中 细胞因子IL-5的水平。
图3C显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型呼吸道灌洗液中 细胞因子IL-13的水平。
图3D显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型呼吸道灌洗液中 细胞因子IFN-y的水平。
8图3E显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型肺引流淋巴结细 胞体外经TCS重新刺激后的细胞因子IL-4的水平。
图3F显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型肺引流淋巴结细 胞体外经TCS重新刺激后的细胞因子IFN- y的水平。
图3G显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型血清中的IgE水平。
图3H显示了用含佐剂或不含佐剂的TCS诱导的动物模型血清中的IgG2a 水平。
图3A-H中，均以采用同样的诱导处理方法，以同样体积PBS溶液处理的小 鼠作为阴性对照(PBS对照组)。
图4A显示了以0VA或TCS + 0VA或铝佐剂(alum)十OVA诱导的动物模型呼吸 道灌洗液中浸润的炎性细胞总数比较。
图4B显示了以OVA或TCS + OVA或铝佐剂(alum) +(^八诱导的动物模型呼吸
道灌洗液中嗜酸性粒细胞数比较。
图4C显示了以OVA或TCS + OVA或铝佐剂(alum) + OVA诱导的动物模型的血 清中抗原特异性IgE的水平比较。
图4D显示了以OVA或TCS + OVA或铝佐剂(alum) +OVA诱导的动物模型的 肺组织切片。
图4A-D中，均以采用同样的诱导处理方法，以同样体积PBS溶液处理的小 鼠作为阴性对照(P B S对照组)。
具体实施例方式
本发明人经过广泛且深入的研究，出乎意料地发现，以天花粉蛋白(TCS) 免疫哺乳动物，可诱导哺乳动物发生过敏性哮喘，并且无需佐剂参加即可发生。 这种过敏性哮喘动物具有过敏性哮喘的典型特征，可作为动物模型，良好地模 拟体内过敏性哮喘的发生发展。同时，所述动物模型还可应用于筛选抗过敏性 哮喘的药物。在此基础上完成了本发明。
所述的"过敏性哮喘"是指一种哺乳动物的疾病，通常由过敏原引起，其主 要特征表现为以下的部分或全部血清中IgE水平升高，呼吸道或肺部炎性细胞增
9多，肺部嗜酸性粒细胞增多，黏液分泌过多，呼吸道非特异性反应增强；此外，"过 敏性哮喘"还可表现为呼吸道或肺组织一类白细胞介素(如IL-4、 IL-5或IL-13) 的量增加。此外，"过敏性哮喘"还可表现为肺组织一类白细胞介素(如IL-4、 IL-5 或IL-13)的量增加。具有上述部分或全部特征的动物可被认为患"过敏性哮喘"。 "过敏性气道炎"是"过敏性哮喘"的主要症状之一。
天花粉蛋白
天花粉蛋白 (trichosanthin ; TCS)分离自中药天花粉(/fe心x 7yyc力o幼力中，以往天花粉被作为一种用于引产的中药。
临床实验证明天花粉蛋白不仅可以引产，还有抗肿瘤和抗艾滋病毒作用。 已发现临床上天花粉蛋白能够引起患者的过敏反应，严重的可以造成过敏性休 克而致死。天花粉蛋白过敏的个体，血清中的天花粉蛋白特异的IgE水平显著 上升，并且在几年内，可以维持在一个较高的水平。尽管目前已知天花粉蛋白 是一个较强的过敏原，可引起机体免疫反应和产生抗体，然而目前还没有人发 现其可特异地诱导过敏性哮喘哮喘并将之用于建立过敏性哮喘模型。也即目前 已经知道天花粉蛋白可系统性地引起免疫反应，但没有技术人员发现其对特定 器官是否有典型的影响。
在本发明中，所用的天花粉蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分 离自中草药(如天花粉)中。优选的，所述天然存在的天花粉蛋白的氨基酸序列 可以与GenBank登录号AY669811所记载的序列基本上相同。此外，所述的天花 粉蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的 天花粉蛋白。
本发明还包括天花粉蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的天花粉蛋白相同的生 物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是有一个或 多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，在一 个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或附加的氨基酸序列融合到此多 肽序列而形成的多肽。
本发明也可采用经修饰或改良的天花粉蛋白，比如，可采用为了促进其半 衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的天花粉蛋白。也即， 任何不影响天花粉蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
10本发明提供一种天花粉蛋白(TCS)的用途，用于制备诱导非人哺乳动物发 生过敏性哮喘的组合物。优选地，所述的组合物中不含有佐剂。
此外，天花粉蛋白还可用于增加非人哺乳动物肺组织炎性细胞或嗜酸性粒 细胞的数量；或用于增加非人哺乳动物肺组织中细胞因子IL-4、 IL-5或IL-13 的水平；或用于增加非人哺乳动物血清中IgE型免疫球蛋白的水平。
此外，所述的天花粉蛋白还可用于作为鸡卵清白蛋白(OVA)的佐剂，来诱 导过敏性气道炎。本发明人的研究发现，天花粉蛋白可取代铝佐剂，并且比铝 佐剂的效果更优异。
天花粉蛋白是个自然状态下的过敏原，能够引起人类的过敏反应，不同于 现有的鸡卵清白蛋白(OVA)只能通过佐剂的辅助才能引起过敏且其本身不是一 个在人体引发疾病的过敏原，所以用天花粉蛋白诱导的过敏性哮喘模型能更好 的模拟人类疾病的发生。因此，由天花粉蛋白诱导的哮喘模型有别于鸡卵清白 蛋白诱导的模型，且天花粉蛋白诱导的病理损伤，更接近于临床，可良好地用 于抗过敏性哮喘药物的筛选和更好地研究过敏反应的发病机制。
并且，以往建立小鼠过敏性哮喘模型都是需要在免疫佐剂(如氢氧化铝)的 辅助免疫下才能完成模型的诱导，而本发明釆用天花粉蛋白进行诱导，不需要 免疫佐剂的辅助即可独立完成疾病模型的诱导，这也更类似于人类的发病过 程。
动物模型的构建及其用途
本发明中，所述的"非人哺乳动物"包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、 猿猴。所述的非人哺乳动物在基因组的组成、器官解剖、个体的发育、代谢方 式、疾病发病机制等方面和人类接近，可良好地应用于人类疾病发病机制、药 物药理学研究等方面。优选的，所述的非人哺乳动物是鼠(如小鼠)。
本发明的过敏性哮喘动物模型是采用天花粉蛋白免疫非人哺乳动物而制备 的。免疫的方法是非人哺乳动物腹腔注射天花粉蛋白，和/或用含天花粉蛋白的 气雾剂攻击非人哺乳动物。作为本发明的优选方式，先对哺乳动物进行天花粉蛋白 系统免疫，然后对哺乳动物进行呼吸道天花粉蛋白气雾攻击，从而建立过敏性哮喘 模型。
11在本发明的一个优选实例中，采用天花粉蛋白在第1、 14天两次进行系统免 疫(腹腔注射天花粉蛋白)；然后在第21-23天连续3天用超声雾化的天花粉蛋白溶 液进行呼吸道途径攻击，从而建立过敏性哮喘动物模型。在构建模型过程中，不需 要佐剂的参与即可完成。
在利用天花粉蛋白诱导后，本发明人利用多种过敏性哮喘疾病相关的指标 来验证建立模型成功与否。验证发现，采用天花粉蛋白诱导后，动物的肺组织 中炎症细胞总数显著上升，嗜酸性细胞总数显著上升，动物的血清中IgE的含 量显著上升。此外，从细胞因子来看，采用天花粉蛋白诱导后，动物的肺组织 中IL-4、 IL-5、 IL-13的含量均显著升高，且还高于天花粉蛋白和佐剂联合应 用的情况。综合这些指标可知，本发明人利用天花粉蛋白成功构建了过敏性哮 喘动物模型。
本发明的过敏性哮喘模型，可用于研究和阐述过敏性哮喘的细胞乃至分子 水平上的发病机制。研究和阐述天花粉蛋白引起Th2类型免疫反应的机制，为 开发治疗过敏性哮喘的药物提供途径。另一方面，还可用于寻找树突状细胞(DC) 在天花粉蛋白作用下发生表型和功能改变过程中的关键分子和信号通路，来进 一步研究DC在调控Th细胞分化过程中所发生的生物学事件和起重要作用乃至 决定性作用的分子。
筛选新药
本发明利用天花粉蛋白成功建立了过敏性哮喘模型，所述模型可应用于抗 过敏性哮喘药物的筛选。
因此，本发明提供了一种筛选抗过敏性哮喘的潜在物质的方法，所述方法 包括步骤(1)将候选物质给予过敏性哮喘的非人哺乳动物(测试组)，所述的非 人哺乳动物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳动物；(2)检测动物呼吸道或肺组织 内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细胞因子的水平、或血清中IgE型免 疫球蛋白的水平，若呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性 细胞因子的水平、或血清中IgE型免疫球蛋白的水平下降，则表明该候选物质 抗过敏性哮喘的潜在物质。
作为本发明的优选方式，还设置对照组，所述的对照组是不给予候选物质
且其它条件与测试组相同的过敏性哮喘的非人哺乳动物。通过比较，如果测试组 呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细胞因子的水平、或
12血清中IgE型免疫球蛋白的水平在统计学上低于(优选显著低于，如低20%;优 选的低40%;更优选的低60%或更低)对照组，则表明该候选物质是抗过敏性哮
喘的潜在物质。
上述筛选出的潜在物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细 胞实验、动物试验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的抗炎症作 用。
由于本发明采用天花粉蛋白进行诱导而没有免疫佐剂的参与，所构建的模 型更类似于人类的发病过程，因而在药物的筛选上比以往的模型(如利用鸡卵 清白蛋白构建的模型)更为精准，效率更高。
组合物
本发明的天花粉蛋白还可用于辅助鸡卵清白蛋白，从而可用于建立鸡卵清 白蛋白特异性的过敏性哮喘模型(如过敏性气道炎模型)。该模型同样可被用于 筛选抗过敏性哮喘的药物，因此该模型也被包含在本发明中。利用该模型筛选 药物的方法基本同利用天花粉诱导的过敏性哮喘动物模型的方法，所述方法也 被包括在本发明中。
本发明人发现，利用天花粉蛋白辅助鸡卵清白蛋白建立过敏性气道炎动物 模型，效果比利用铝佐剂辅助更为优异，可产生更多的炎性细胞。
因此，本发明还提供一种引发过敏性哮喘的组合物，所述的组合物含有有 效量(如0.5-50%;较佳的1-20%;更佳的1-10%)的鸡血清白蛋白和有效量(如 0.5-50%;较佳的1-20%;更佳的1-10%)的天花粉蛋白。
可随免疫动物的种类不同调节鸡血清白蛋白和天花粉蛋白的使用剂量以及它 们之间的使用比例。最佳使用量以能引起动物明显的过敏性哮喘症状且无其它过度
不良反应为准。所述的鸡血清白蛋白和天花粉蛋白的比例通常在1:100-100:1; 1:10-10:1;优选的鸡血清白蛋白和天花粉蛋白的重量比例为1:5-5:1。
作为本发明的优选方式，当用于免疫小鼠时，天花粉蛋白通常的用量在1-1000 Ug之间，较佳的在5ug-500ug之间，更佳的在5ug-50ug之间；鸡血清白蛋 白通常的用量在lu g-1000ii g之间，较佳的在lOu g-500ix g之间。
在另一优选例中，所述的组合物中还含有有效量的药学上或免疫学上可接受 的载体，所述的载体是适用于哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变 态反应)的物质，包括各种赋形剂和稀释剂。它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。 本发明的主要优点在于
(1) .本发明首次揭示以天花粉蛋白免疫哺乳动物，在没有佐剂参加的情 况下即可诱导哺乳动物发生过敏性哮喘，更类似于人类的发病过程。
(2) .本发明的动物模型具有过敏性哮喘的典型特征，可极好地模拟体内 过敏性哮喘的发生发展，从而可良好地应用于筛选抗过敏性哮喘的药物。
(3) .本发明还揭示天花粉蛋白可作为佐剂辅助鸡卵清白蛋白，用于建立 过敏动物模型。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l小鼠过敏性哮喘模型的建立
1. 建立由天花粉蛋白和铝佐剂诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型l)
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天、14天腹腔注射天花粉蛋白(TCS， 纯度99°/。的天花粉提取物，购自上海金山制药有限公司)的PBS溶液，剂量为 5ug/200ul PBS/鼠，跟lmg的铝佐剂(Al咖，氢氧化铝在PBS中的悬浊液，其中 含氢氧化铝10%)混合。从第21天到第23天，连续3天对小鼠进行抗原的呼吸道 攻击，每天30分钟，用超声雾化器雾化含TCS的PBS溶液，剂量为2mg/ml。最后 一次抗原攻击24小时后，解剖小鼠以进行测试。采用同样的处理方法，以不含 TCS的同样体积含铝佐剂(lmg)的PBS溶液处理小鼠，以作为阴性对照(PBS十 Alum对照组)。
2. 建立由天花粉蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型2)C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天、第14天腹腔注射含天花粉蛋白的 PBS溶液(注这里不加任何佐剂)，剂量为5ug/200ul PBS/鼠。从第21天到第 23天，用超声雾化器雾化天花粉溶液，连续3天对小鼠进行抗原的呼吸道攻击， 剂量为2mg/ml，每天攻击30分钟。最后一次抗原攻击24小时后，解剖小鼠以进 行测试。
3. 建立由鸡卵清白蛋白和铝佐剂诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型3)
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天，第14天腹腔注射含鸡卵清白蛋白 (OVA，购自Sigma公司)的PBS溶液，剂量为10ug/200y 1 PBS/鼠，跟lmg的铝佐 剂混合。从第21天到第23天，连续3天对小鼠进行抗原的呼吸道攻击，每天30 分钟，用超声雾化器雾化TCS的PBS溶液，剂量为W(m/v)。最后一次抗原攻击 24小时后，解剖小鼠以进行测试。采用同样的处理方法，以不含OVA的含铝佐 剂的PBS溶液处理小鼠，以作为阴性对照(PBS+Alum对照组)。
4. 建立由鸡卵清白蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型4)
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天，第14天腹腔注射含鸡卵清白蛋白 的PBS溶液，剂量为10ug/200ul PBS/鼠(注这里没加佐剂)。从第21天到第 23天，连续3天对小鼠进行抗原的呼吸道攻击，每天30分钟，用超声雾化器雾 化TCS的PBS溶液，剂量为iy。(m/v)。最后一次抗原攻击24小时后，解剖小鼠进 行测试。
实施例2小鼠过敏性哮喘模型测试
对实施例l制备的各小鼠模型进行测试，测试的指标包括浸润到气道中 炎症细胞的总数、嗜酸性细胞的数量、以及血清中IgE的水平和肺组织的病理
切片。肺部支气管灌洗液浸润的总炎症细胞量和嗜酸性粒细胞含量可验证TCS 是否引起过敏性呼吸道炎症。
检测方法如下小鼠眼球取血，血液凝集取血清；小鼠处死，结扎左肺， 分离气管，用9号针头插入小鼠气管，分3次注射0.5ml的PBS溶液灌洗气道并吸 出，灌洗液待测浸润细胞数和细胞因子。分离左肺进行病理切片。血清中IgE 量的检测釆用ELISA方法。
对呼吸道灌洗液中的细胞总数进行计数，测得各模型浸润的炎性细胞总数
15见图1A(模型1和模型3)和2A(模型2和模型4)。可见，在佐剂存在的情况下，鸡
卵清白蛋白和天花粉蛋白诱导的小鼠模型中炎性细胞总数接近，且显著高于 PBS+佐剂对照组。而在佐剂不存在的情况下，鸡卵清白蛋白诱导的小鼠模型中 炎性细胞总数远低于天花粉蛋白诱导的小鼠模型，几乎没有炎性细胞。
用呼吸道灌洗液取20u l涂片，进行常规的H&E染色，然后随机取200个细 胞/载玻片进行统计，计数其中嗜酸性粒细胞，结果见图1B(模型1和模型3)和 图2B(模型2和模型4)。可见，在佐剂存在的情况下，鸡卵清白蛋白和天花粉蛋 白诱导的小鼠模型中嗜酸性粒细胞总数接近，且显著高于PBS对照组。而在佐 剂不存在的情况下，鸡卵清白蛋白诱导的小鼠模型中嗜酸性粒细胞总数远低于 天花粉蛋白诱导的小鼠模型。
用ELISA的方法测定血清中抗原特异性IgE的水平，结果测得的IgE的量见 图1C和图2C。可见，在佐剂存在的情况下，鸡卵清白蛋白诱导的小鼠模型中IgE 的量明显低于天花粉蛋白诱导的模型，但两者均高于PBS对照组。而在佐剂不 存在的情况下，鸡卵清白蛋白诱导的小鼠模型中IgE的量远低于天花粉蛋白诱 导的小鼠模型，几乎不存在。
肺组织的病理切片方法为常规方法，主要如下分离左肺，固定，脱水， 石蜡包埋，切片，服E染色观察，拍照。结果见图1D(模型1和模型3)和图2D(模 型2和模型4)。
综上可见，天花粉蛋白在佐剂存在与不存在的情况下都能够诱导小鼠产生 过敏性呼吸道炎症。而血清白蛋白在佐剂不存在的情况下难以诱导小鼠产生过 敏性呼吸道炎症。
实施例3天花粉蛋白在体内引起的是Th2类型免疫反应
本实施例中，通过检测天花粉蛋白诱导的动物模型肺部灌洗液中Th2类型 细胞因子IL-4， IL-5和IL-13的含量，确定TCS诱导的过敏性哮喘的类型。 以PBS对照组作为对照。
IL-4， IL-5、 IL-13、 INF-Y、 IgE、 IgGl、 IgG2a的检测根据常规的方法 进行。
结果见图3，其中，支气管灌洗液(BALF)中测定细胞因子IL-4(A)，IL-5(B)， IL-13(C)， INF-Y (D)的表达；肺引流淋巴结细胞在体外经TCS重新刺激后(LNs)
16测定细胞因子IL-4(E), INF-y (F)的表达。血清中免疫球蛋白的水平测定指标 为总的IgE水平(G)， TCS特异的IgG2a(H)。可见，在天花粉蛋白(存在或不存 在佐剂)诱导的动物模型的支气管灌洗液(BALF)中，IL-4， IL-5和IL-13含量 显著高于PBS组，且天花粉蛋白单独诱导的小鼠模型中这些因子的含量明显高 于天花粉蛋白+佐剂诱导的小鼠模型；在肺引流淋巴结细胞体外经TCS重新刺 激后，IL-4含量显著高于PBS组。并且，在天花粉蛋白(存在或不存在佐剂) 诱导的动物模型中IgE含量显著高于PBS组，且天花粉蛋白单独诱导的小鼠模 型中这些因子的含量明显高于天花粉蛋白+佐剂诱导的小鼠模型。而IFN-y以 及IgG2a在天花粉蛋白单独诱导的小鼠模型中均没有显著升高。
通过检测肺组织局部的细胞因子，以及血清中代表Th2免疫反应的两类免 疫球蛋白类型IgE和IgGl，确定经TCS处理过的小鼠发生的是Th2类型免疫反 应。
实施例4 TCS可以作为佐剂辅助OVA诱导OVA特异性的过敏性气道炎
在经典方式OVA致敏小鼠时，用TCS可以替代Alum，用作佐剂辅助OVA致 敏(图4)。
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天，第14天腹腔注射含鸡卵清白蛋白 的PBS溶液，剂量为10ug/200u 1 PBS/鼠(注这里不加佐剂)。在鸡卵清白 蛋白注射的前一天，分别用PBS(阴性对照)或者天花粉蛋白(5u g/200u 1 PBS / 鼠)或者铝佐剂.(lmg/鼠)注射小鼠(也可将10ug鸡卵清白蛋白与5!xg天花粉蛋 白混合，加入PBS后免疫小鼠)。从第21天到第23天，连续3天对小鼠进行抗原 的呼吸道攻击，每天30分钟，用超声雾化器雾化鸡卵清白蛋白的PBS溶液，剂 量为1%( m/V)。最后一次抗原攻击24小时后，解剖小鼠进行测试。测定包括 浸润到气道中炎症细胞的总数、嗜酸性细胞的数量以及血清中IgE的水平。测 定方法同前述。
对呼吸道灌洗液中的细胞总数进行计数，测得浸润的炎性细胞总数见图 4A。可见，用天花粉蛋白和鸡卵清白蛋白(TCS + OVA)诱导的小鼠模型中炎性细 胞数量明显高于阴性对照组和单用鸡卵清白蛋白组(OVA)，且还高于鸡卵清白 蛋白+佐剂组(alum+0VA)。
用呼吸道灌洗液取20u l涂片，进行服E染色，然后随机取200个细胞/载玻 片进行统计，计数其中嗜酸性粒细胞，结果见图4B。可见用天花粉蛋白和鸡卵
17清白蛋白诱导的小鼠模型中嗜酸性粒细胞数量明显高于阴性对照组和单用鸡 卵清白蛋白组，且略高于鸡卵清白蛋白+佐剂组。
用ELISA的方法测定血清中抗原特异性IgE的水平(用OVA包板)，结果见图 4C。可见用天花粉蛋白和鸡卵清白蛋白诱导的小鼠模型中炎性细胞数量明显高 于阴性对照组和单用鸡卵清白蛋白组。肺组织切片见图3D。
因此可见，天花粉蛋白可以作为佐剂辅助鸡卵清白蛋白诱导鸡卵清白蛋白 特异性的过敏性气道炎。
此外，采用如前所述相同的方法，利用20wg鸡卵清白蛋白与8ug天花 粉蛋白混合，加入PBS后腹腔注射小鼠，之后采用同样方法进行呼吸道攻击， 结果提示也可以诱导显著的过敏性气道炎。
实施例5药物筛选
以实施例1制备的过敏性哮喘模型2为受试对象，检测候选物质刺激前后 动物肺组织中炎性细胞数、嗜酸性细胞数以及细胞因子IL-4、 IL-5、 IL-13的 量，从而判断候选物质是否对于抗过敏性哮喘是有效的。
测试组给予候选物质的模型2;
对照组不给予候选物质的模型2。
如果与对照组相比，测试组中的炎性细胞数、嗜酸性细胞数以及细胞因子 IL-4、 IL-5或IL-13的量下降，则说明该候选物质可抑制过敏性哮喘。
利用患过敏性哮喘动物，对经筛选能够下调肺组织中炎性细胞数、嗜酸性 细胞数以及细胞因子IL-4、 IL-5或IL-13的量的物质进行进一步的动物试验， 进一步验证治疗效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1. 一种天花粉蛋白的用途，其特征在于，用于制备诱导非人哺乳动物发生过敏性哮喘的组合物。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳动物是鼠。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于增加非人哺乳动物肺组织或呼吸道炎性细胞或嗜酸性粒细胞的数量；或用于增加非人哺乳动物肺组织中细胞因子IL-4、 IL-5或IL-13的水平。
4. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于增加非人哺乳动物血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平。
5. —种过敏性哮喘的非人哺乳动物的用途，所述的非人哺乳动物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳动物；所述非人哺乳动物用于筛选抗过敏性哮喘的物质。
6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述由天花粉蛋白免疫非人哺乳动物的方法是先对哺乳动物进行天花粉蛋白系统免疫，然后对哺乳动物进行呼吸道天花粉蛋白气雾攻击。
7. —种筛选抗过敏性哮喘的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(1) 将候选物质给予过敏性哮喘的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳动物；(2) 检测动物呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平，若动物呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平下降，则表明该候选物质是抗过敏性哮喘的潜在物质。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(l)包括在测试组中，将 候选物质给予过敏性哮喘的非人哺乳动物；和/或步骤(2)包括检测测试组动物呼吸道或肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症性细胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平，并与对照组比较，其中所述的对照组是不给予候选物质的过敏性哮喘的非人哺乳动物；如果测试组中动物肺组织内炎性细胞数、嗜酸性粒细胞数、炎症 性细胞因子的水平、或血清中抗原特异性IgE型免疫球蛋白的水平在统计学上 低于对照组，则表明该候选物质是抗过敏性哮喘的潜在物质。
9. 一种引发过敏性哮喘的组合物，其特征在于，所述的组合物含有 有效量的鸡血清白蛋白；和有效量的天花粉蛋白。
10. 权利要求9所述的引发过敏性哮喘的组合物的用途，其特征在于，用于 制备诱导非人哺乳动物发生过敏性哮喘的组合物。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了天花粉蛋白在制备小鼠过敏性哮喘模型中的用途，所述的天花粉蛋白不需要佐剂的辅助即可发挥作用。本发明还公开了一种由天花粉蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘疾病模型。本发明建立的过敏性哮喘动物模型具有过敏性哮喘疾病的典型特征，可良好地模拟体内过敏性哮喘的发生发展。同时，所述动物模型还可应用于筛选抗过敏性哮喘的药物。
文档编号A61K49/00GK101496904SQ20081003325
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者兵 孙, 毛开睿, 媛 王 申请人:中国科学院上海生命科学研究院