一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别是涉及植物毛状根瞬时表达重组蛋白的方法，更为具体的说是涉及一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]随着生物技术的快速发展，重组蛋白的体外表达在医药研发和应用中越来越广泛。传统的重组蛋白的表达生产主要依赖微生物发酵和哺乳动物细胞培养，但这些体系生产成本高，规模化生产困难，安全性较差，随着生物科研及医药市场对重组蛋白需求的不断增长，迫切需要寻找一种新的途径来缓解科研及医药市场对重组蛋白的需求。目前，转基因植物已经能够表达诸如疫苗、抗体和哺乳动物酶等重组蛋白。与哺乳动物细胞培养和微生物发酵相比，源于植物的重组蛋白因生产成本低、易于操作、安全性好以及翻译后修饰而引起广泛关注。
[0004]然而，转基因植物可能通过异花传粉将基因传给野生型亲源物种，因此选择野外转基因栽培植株的转基因方法会受到很多法规的限制。
[0005]毛状根是发根农杆菌侵染植物受伤部位而产生的一种病理表现。发根农杆菌为根瘤菌科。
[0006]农杆菌属中一类具有侵染性的革兰氏阴性土壤杆菌，它能够侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别裸子植物。当发根农杆菌感染植物细胞后，其Ri质粒(rootinducing plasmid)的T 一 DNA片段整合引入宿主植物的核基因组中，最终导致根瘤和根毛的增生，使根部呈毛发状，形成“毛状根”。通过转基因毛状根的大量培养可以富集并纯化获得植物中目标重组蛋白。
[0007]毛状根培养正以其特有的优势逐渐成为另一生产重组蛋白的方法，它可通过有丝分裂和细胞分裂稳定地遗传，不仅避开了转基因改良田地作物的政策限制，而且建立了经济简便和生长迅速的组织特异性培养体系，能大量、均一地表达靶基因产物，具有很强的时效性，60天可建立起毛状根培养体系，同时相关生物量可迅速增长，4?5周内增长120倍，次代培养物目标蛋白亦能够在相当长一段时间内稳定高效表达。
[0008]然而，目前毛状根蛋白表达系统整个构建过程较为复杂，从毛状根诱导到蛋白小量表达周期最短也需4-6月，大量表达的周期更长，从毛状根中提取纯化重组蛋白同样需要较多的时间，获得高纯度蛋白成本较高，研宄人员各自研宄感兴趣的植物表达系统且多处于研宄阶段，因此目前需要一种快速高效的毛状根通用表达系统用于重组蛋白的表达。
[0009]
【发明内容】
[0010]本发明利用生长迅速的单克隆烟草毛状根作为宿主，通过农杆菌介导病毒表达载体快速表达外源蛋白，并分泌到培养基中，从而建立了一种快速高效的毛状根通用表达系统用于重组蛋白的表达。
[0011]本发明所公开的技术方案如下:
一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法，该方法包括以下各步骤:
(1)烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建:以限制性核酸内切酶Pa C I和No t I双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO — ZB和克隆载体P E A S Y —重组蛋白的质粒DNA，产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用T 4 DNA连接酶于4 ^连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌D H 5 α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养，小提质粒后用限制性内切酶P a c I和N ο t I进行酶切鉴定；
(2)取含目的基因的质粒各5ul分别与100 ul农杆菌GV3101感受态细胞均匀混合，置于冰上I min后；加入到灭菌的电击杯中进行电击转化，培养后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定；
(3)将菌液按体积比1:25转接入IM培养基中，28 °0振荡培养16~ 18 h，振荡培养至A 600约为1.0，离心收集农杆菌，10 mmol/ L MgC12，10 mmol/L MES等体积重悬，再次离心收集菌体，10 mmo I/ L MgC12，10 mmol/ L MES, 200 mmo I/ L AS等体积重悬，室温静止2~ 3 h后即可接种，将重组农杆菌悬浮浸润烟草毛状根，25°C摇床暗培养过夜，并置于MS+ 4 O m g/L头孢噻唑钠中除菌培养12h，转接1/2MS液体培养基，135rpm、25°C摇床暗培养5d，收集MS培养液；
(4)通过无机陶瓷膜过滤，去除小分子杂质，将保留的目的蛋白粗品通过镍亲和柱进行蛋白纯化，纯化后进行SDS-PAGE，纯度鉴定，能获得IMG以上，纯度大于90%的重组蛋白。
[0012]进一步地，所述培养基为50 mg / L Kan, 50 mg / L Rif，50 mg/ L Gen。
[0013]本发明中所述烟草毛状根预先在室温下复苏，并于无菌条件下接种于1/2MS液体培养基，135rpm、25°C摇床暗培养过夜。
[0014]从而获得一种快速高效的毛状根通用表达系统，可以用于重组蛋白的表达。
[0015]
【具体实施方式】
[0016](I)烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建:以限制性核酸内切酶P a c I和N ο tI双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO — ZB和克隆载体P E A S Y —重组蛋白的质粒DNA，产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用T 4 DNA连接酶于4 ^连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌D H 5 α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养，小提质粒后用限制性内切酶P a c I和N ο t I进行酶切鉴定；
(2)取含目的基因的质粒各5ul分别与100 ul农杆菌GV3101感受态细胞均匀混合，置于冰上I min后；加入到灭菌的电击杯中进行电击转化，培养后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定；
(3)将菌液按体积比1:25转接入IM培养基中，28 °0振荡培养16~ 18 h，振荡培养至A 600约为1.0，离心收集农杆菌，10 mmol/ L MgC12，10 mmol/L MES等体积重悬，再次离心收集菌体，10 mmo I/ L MgC12，10 mmol/ L MES, 200 mmo I/ L AS等体积重悬，室温静止2~ 3 h后即可接种，将重组农杆菌悬浮浸润烟草毛状根，25°C摇床暗培养过夜，并置于MS+ 4 O m g/L头孢噻唑钠中除菌培养12h，转接1/2MS液体培养基，135rpm、25°C摇床暗培养5d，收集MS培养液；
(4)通过无机陶瓷膜过滤，去除小分子杂质，将保留的目的蛋白粗品通过镍亲和柱进行蛋白纯化，纯化后进行SDS-PAGE，纯度鉴定，能获得IMG以上，纯度大于90%的重组蛋白。
【主权项】
1.一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下各步骤: (1)烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建:以限制性核酸内切酶Pa C I和No t I双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO — ZB和克隆载体P E A S Y —重组蛋白的质粒DNA，产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用T 4 DNA连接酶于4 ^连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌D H 5 α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养，小提质粒后用限制性内切酶P a c I和N ο t I进行酶切鉴定； (2)取含目的基因的质粒各5ul分别与100 ul农杆菌GV3101感受态细胞均匀混合，置于冰上I min后；加入到灭菌的电击杯中进行电击转化，培养后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定； (3)将菌液按体积比1:25转接入IM培养基中，28 °0振荡培养16~ 18 h，振荡培养至A 600约为1.0，离心收集农杆菌，10 mmol/ L MgC12，10 mmol/L MES等体积重悬，再次离心收集菌体，10 mmo I/ L MgC12，10 mmol/ L MES, 200 mmo I/ L AS等体积重悬，室温静止2~ 3 h后即可接种，将重组农杆菌悬浮浸润烟草毛状根，25°C摇床暗培养过夜，并置于MS+ 4 O m g/L头孢噻唑钠中除菌培养12h，转接1/2MS液体培养基，135rpm、25°C摇床暗培养5d，收集MS培养液； (4)通过无机陶瓷膜过滤，去除小分子杂质，将保留的目的蛋白粗品通过镍亲和柱进行蛋白纯化，纯化后进行SDS-PAGE，纯度鉴定，能获得IMG以上，纯度大于90%的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述培养基为50mg / L Kan, 50 mg / LRif ,50 mg/ L Gen。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述烟草毛状根预先在室温下复苏，并于无菌条件下接种于1/2MS液体培养基，135rpm、25°C摇床暗培养过夜。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别是涉及植物毛状根瞬时表达重组蛋白的方法，更为具体的说是涉及一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法。用生长迅速的单克隆烟草毛状根作为宿主，通过农杆菌介导病毒表达载体快速表达外源蛋白，并分泌到培养基中，从而建立了一种快速高效的毛状根通用表达系统用于重组蛋白的表达。
【IPC分类】C12N15-84, A01H5-06
【公开号】CN104774868
【申请号】CN201510123503
【发明人】曹亮
【申请人】南京钟鼎生物技术有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月20日