一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，属于生物工程技术 领域。
【背景技术】
[0002] 食品安全是关系到人类健康和国计民生的重大问题。在众多威胁食品安全的污染 源中，微囊藻毒素（MCs)由于毒性强、在食物链中波及范围广，日益成为危害人类健康的重 要杀手。MCs是一类单环走肤物质，其化学性质稳定，自然降解缓慢。由于微生物具有使用 成本低、运行周期短等特点，在生物防治MCs中具有较大的应用潜力和研究价值。其中，益 生菌对MCs的干预作用因其公认的安全性（GRA巧成为真正能够实现在清除MCs过程中与 水源、食品"零距离"接触的生物防治剂。
[000引然而，益生菌对MCs的干预作用的机理并不明确。一方面，益生菌自身的性能决定 了其对MCs的干预能力W及特有的干预作用机制，该取决于其基因型，W及由此表现出的 对MCs的代谢转化性能，或是对MCs进行结合、吸附的结构或形态特征。另一方面，微生物 的内在、外在环境又影响并改变着它对MCs的干预过程和干预效果，如所处胃肠道的不同 生理环境、MCs的胁迫条件等。该些改变可能设及到益生菌的转录组、蛋白组、代谢组的变 化及整个代谢网络的调整，从而实现了对MCs的转化。因此，益生菌清除MCs技术的建立 不仅建立在对益生菌性能及其去毒机制的解析之上，也建立在对益生菌干预过程的理解之 上，该样才能最终实现益生菌对MCs的高效干预与控制。
[0004] 在利用乳杆菌对MCs进行清除的研究中发现，由于菌株受到MCs的胁迫作用，导致 菌株的活性受到影响，进而影响其清除效果。但是MCs对菌株的胁迫机理也不明确。发明 人研究了MCs胁迫条件下LactobacilluscaseiATCC334的蛋白质组学，研究发现，其分子 伴侣Gro化蛋白表达受到MCs胁迫的影响。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种提高乳酸乳球菌抵御MCs胁迫的方法，从而提高乳酸乳球菌对 于MCs胁迫条件的适应能力。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种提高乳酸菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，所述方 法是在乳酸菌中过表达氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的分子伴侣蛋白GroEL。
[0007] 所述乳酸菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌或者干酪乳杆菌。
[000引所述分子伴侣蛋白，在本发明的一种实施方式中，其核巧酸序列如SEQIDNO. 2所 /J、-0
[0009] 所述分子伴侣蛋白，在本发明的一种实施方式中，来源于干酪乳杆菌L.casei ATCC3：M。
[0010] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是WLlactisNZ9000为宿主，W表达质 粒pNZ8148、PNZ8048、pNZ5319中的一种为载体，过表达分子伴侣蛋白。
[0011] 本发明的第二个目的是提供一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸菌，所述乳酸菌 过表达氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述的分子伴侣蛋白。
[0012] 所述乳酸菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌或者干酪乳杆菌。
[0013] 所述乳酸菌，在本发明的一种实施方式中，是W乳酸乳球菌L.lactisNZ9000为宿 主，W表达质粒PNZ8148为载体，过表达分子伴侣蛋白的重组乳酸菌。
[0014] 一种构建所述乳酸菌的方法，在本发明的一种实施方式中，所述方法包括；（1)使 用引物mutRF、mutRR对表达质粒PNZ8148上的化〇1位点进行定点突变，得到PNZ8148/ 化〇1 ; (2)将序列如SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列克隆到pNZ8148/NcoI上，得到重组质 粒pNZ8148/NcoI/GroEL; (3)将pNZ8148/NcoI/Gro化转化到L.lactisNZ9000 中，即得到 重组菌株L.lactisNZ-GroEL。
[0015] 所述乳酸菌在清除微囊藻毒素方面、制备生物防治剂方面的应用也属于本发明要 求保护的范围。
[0016] 本发明的有益效果；本发明通过在乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中过量表 达GroEL蛋白，得到了一株MCs胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ-GroEL。生长性能试验表明，MCs胁迫条件下培养2化后，L.lactisNZ-Gro化菌株相比 对照生物量提高了约15. 2%;在MCs浓度分别为50yg/mL和100yg/mL的GM17中胁迫12h 后的重组菌对MCs的耐受性分别比对照菌提高了 10. 6%和20. 1%。
【附图说明】
[0017] 图1;重组质粒pNZ8148/NcoI/GroEL的构建流程图；
[0018] 图2;重组菌株L.lactisNZ-GroEL蛋白表达SDS-PAGE电泳图；其中，M代表 marker,泳道1为对照菌株NZ-Vector，泳道2为重组菌NZ-GroEL;
[0019] 图3 ;MCs胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比图，其中实屯、S角形代 表NZ-Veotor，空屯、S角形代表NZ-GroEL。
[0020] 图4 ;MCs胁迫条件下，重组菌株与对照菌株存活率对比图；其中A为50yg/mL MCs胁迫，B为lOOyg/mLMCs胁迫，其中实屯、S角形代表NZ-Veotor，空屯、S角形代表 NZ-GroEL。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
[0022] 实施例1重组菌株的构建
[002引 重组菌LactococcuslactisNZ-GroE；L包括；
[0024] (1)为避免移码突变，对表达质粒PNZ8148上的化oI位点进行定点突变，使用序列 为SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 的突变引物（见表 1 的mutRF、mutRR)，将ATGG突变为ATCG， 得到表达质粒命名为pNZ8148/NcoI;
[0025] (2)WLcaseiATCC334的基因组为模板，根据GroEL的序列（氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示、核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示）设计序列如SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6 的引物（见表1的G-RF、G-RR)，PCR扩增获得目的基因片段。将PCR产物和载体PNZ8148/ 化〇1分别用SpeI和SacI双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌 MC1061感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后 再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/NcoI/GroEL。
[0026] (3)然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactisNZ9000感受态细胞，氯 霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正 确重组质粒的菌株L.lactisNZ-GroEL。质粒构建流程图见图1。
[0027] 其中电转化条件为；1uL质粒中与40yL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯 中，冰上放置lOmin。电压2000V，电容25yF，电阻2000。电击完毕后，立即向电转杯中加 入1血GM17培养基（含20mMMgCl2,2mMCaCg。然后置于30°C静置培养1. 5h，涂布于含 有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。
[0028] 表1引物
[0029]
【主权项】
1. 一种提高乳酸菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸乳球 菌中过表达氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述的分子伴侣蛋白。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子伴侣蛋白的核苷酸序列是SEQ IDNO. 2所不的序列。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子伴侣来源于干酪乳杆菌Lcasei ATCC334。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148为载体，过表达分子伴侣蛋白。
5. -种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌过表达氨基酸序 列如SEQIDNO. 1所述的分子伴侣蛋白。
6. 根据权利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌或者干酪乳 杆菌。
7. 根据权利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌是以乳酸乳球菌 Lactococcus lactisNZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148为载体，过表达分子伴侣蛋白的 重组乳酸菌。
8. -种构建权利要求6-7任一所述乳酸菌的方法，其特征在于，所述方法包括：（1)使 用引物mutRF、mutRR对表达质粒pNZ8148上的NcoI位点进行定点突变，得到pNZ8148/ NcoI; (2)将序列如SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列克隆到pNZ8148/NcoI上，得到重组质 粒pNZ8148/NcoI/GroEL; (3)将pNZ8148/NcoI/GroEL转化到LactococcuslactisNZ9000 中，即得到重组菌株LactococcuslactisNZ-GroEL。
9. 权利要求5-7任一所述乳酸菌在清除微囊藻毒素方面的应用。
10. 权利要求5-7任一所述乳酸菌在制备生物防治剂方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei ATCC334的GroEL基因，得到了一株MCs胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ-GroEL。MCs胁迫条件下，培养22h后重组菌株相对于对照菌株的生物量提高了15.2％。在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中胁迫12h后，重组菌对MCs的耐受性分别比对照菌提高了10.6％和20.1％。本发明提供的方法具有良好的工业应用价值。
【IPC分类】C07K14-195, C12R1-245, A23L1-015, C12N1-21, C12N15-74, C02F3-34
【公开号】CN104774863
【申请号】CN201510144152
【发明人】张娟, 朱政明, 陈坚, 堵国成, 袁凡, 杨佩珊, 徐诞, 陈方林, 殷俊
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月30日