控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A及其CAPS标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A及其CAI^S标记方法。
【背景技术】
[000引小麦（TriticumaestivumL.)是世界上总产量位居第二的粮食作物，提高小麦产 量对国家粮食安全W及增加农业生产效益都具有非常重要的战略意义。千粒重是小麦产量 构成S要素之一，具有较高的遗传力佑iura和Saulescu，1996)，因此，小麦的育种过程在 很大程度上就是不断提高粒重。然而，粒重的分子调控机理仍不清晰。
[0003] 总结前人报道，千粒重属于数量性状，受主效加微效多基因共同控制。目前，粒重 相关WL位点报道较多，广泛分布在小麦21条染色体上（Araki等，1999 ;化址等，1999 ; Kato等，2000;Groos等，2003;Huang等，2003 ;Brese曲ello等，2006;Huang等，2006;Sun 等，2009;Marta等，2013;Simmonds等，2014)。其中主效WL位点位于 1A、3A、4B、5A、6A7A、 7B、7D(Campbell等，2003;Huang等，2003;Vasilis等，2010)。小麦中，调控粒重的部分功 能基因已经被克隆。如Su等（2011)同源克隆了水稻中控制粒宽和粒重的主效基因TaGW2。 Ma等（2012)克隆了与小麦粒重相关的细胞壁转化酶基因化CWI。综合上述可知，千粒重的 遗传机理较复杂，不同材料，遗传背景不同，控制粒重的主效基因也有所差异。鉴定出更多 粒重相关基因，不仅有利于加快多基因聚合育种的进程，同时有助于进一步阐明产量形成 的分子机制。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供控制小麦千粒重的主效基因化TGW-7A及其CAPS 标记方法。
[0005] 本发明是通过W下技术方案来实现的。
[0006] 控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A，品种为京411，其序列如序列表。
[0007] 控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A，品种为红芒春21，其序列如序列表。
[000引小麦千粒重的主效基因化TGW-7A的CAI^S标记方法，步骤包括；
[0009] (1)小麦基因组DNA提取；
[0010] (2)对基因组DNA用限制性内切酶化elll进行酶切，对得到的酶切片段 用KlenowRra卵ent(3 ' - 5 'exo-)(肥B)和dATP在 37°C下进行 3 '端加A处 理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，PCR扩 增引物；FAATGATACGGCGACCACCGA，RCAAGCAGAAGACGGCATACG，文库质检合格后用 Illumin址iSeqTM2500 进行测序；
[0011] 做设计引物：
[0012] TaTGW-7A基因全长引物Q29F;GCAAGCCCGTCAACATGTACTAC， Q29R；AATTTCTGGACTTATGGGGAGCC,Q35F；TCTACCACGCAGCAAATCGCC；Q35R； CTGGACTTATGGGGAGCCTCT;Q37F;GCCCGTCAACATGTACTACTC，Q37R;GGTAGAGCTTCTCATAGCTGC， 拼接引物上游 29PF;AAGGTTTGGGGAGTAAAGTTTT，29PR;AGTCAGAATTGTGCCTAAGTGC; 下游 31PF;GAGGGGTAGGATGAAGGAAGA，31PR;ATTTCTGGACTTATGGGGAGC，mRNA序 列SRF;ACCCATCCCTCCATCCGTCG，SRR;ATCCGCCCACCTGGTAAAGC，酶切引物MQF; GCTACATACACGCACCAACCC,MQR；GACGAGAAGATAGGCGGACAG
[001引引物Q29、Q35、Q37用于扩增化TGW-7A基因全长，PCR产物直接测序；引物29P和 31P分别扩增TaTGW-7A基因上游和下游，PCR产物克隆测序，并拼接基因全长；引物SR用于 扩增mRNA，产物克隆测序；引物MQ用于CAPS标记开发，用BsmAI(肥B)在55°C下酶切化， 产物在2%的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带。
[0014]进一步地，（1)小麦基因组DNA提取的步骤包括：
[00巧]1)将小麦单巧粒磨碎，取0.Ig加入0. 7血SDS提取液（0. 1MTris-肥1(PH= 8. 5)， 0. 1M化C1，0. 05M邸TA(PH= 8. 0) ,2%SD巧在60°C恒温下裂解45min，其间多次震荡；
[0016] 2)在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin;
[0017] 3)取上清液加入等体积的酪；氯仿；异戊醇（25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很 快分层；
[00化]4)在4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin;
[0019] 5)取上清液加入等体积的酪；氯仿；异戊醇（25:24:1)上下颠倒旋转数次；
[0020] 6)在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin;
[0021] 7)取上清液加入等体积的异丙醇于-20°c冰箱静置30min;
[002引 8)在4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin;
[0023] 9)用70%的己醇洗漆两次；
[0024] 10)在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin;
[0025] 11)沉淀自然风干，4°C存，备用。
[0026] 进一步地，（2)选用拟南芥作为对照进行测序。
[0027]进一步地，（3)CAI^S标记的PCR反应体系；1yL2. 5mMdNTP, 0. 25yLlOuM引物， lyL10 礼aTapBuffer，0. 5UTaKaRaLaTap，100ngDNA模板，用双蒸馈水补齐到lOuL。
[0028] 进一步地，（3)CAI^S标记的PCR反应程序；95°C变性5min;95°C变性45s;55°C退火 50s;72°C延伸 50s，72°C延伸lOmin。35 个循环。
[0029] 进一步地，琼脂糖凝胶电泳；1.5-2%琼脂糖凝胶，缓冲体系为IXTAE溶液，在 100V恒压下，电泳50min，漠化己锭巧B)染色，凝胶成像系统扫描并保存。聚丙締酷胺凝 胶电泳；6%的变性聚丙締酷胺凝胶，缓冲体系为1XTBE溶液，电压1200V，电流55A，功率 55W，电泳 9〇-110min。
[0030] 本发明的主要原理是：
[0031](一）简化基因组测序技术（1)基于生物信息学进行方案系统设计利用生物信息 学方法，对小麦的参考基因组（或已知BAC序列）进行系统分析，根据基因组的GC含量、 重复序列情况和基因特点等信息，设计标记开发方案，W保证其分子标记开发的密度、均匀 性、效率和关联分析的准确性。（2)SLAF-seq文库构建及测序选择小麦作为研究材料，构建 SLAF-seq文库，根据前期信息学方法设计的方案，筛选特异性长度片段，应用高通量测序技 术获得海量标签序列。（3)SLAF-seq数据分析对数据进行基本处理，对测序数据进行评估， 获得测序深度和质量满足要求的SLAF片段，来代表小麦基因组信息。本发明利用SLAF-seq 技术鉴定了小麦粒重相关基因的热点区域。
[003引（二）聚合酶链式反应（PCR)，反应步骤；①模板DNA的变性：模板DNA经加热至 93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， W便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）；模板DNA经加 热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；⑨引物的 延伸；DNA模板--引物结合物在化qDNA聚合酶的作用下，WdNTP为反应原料，祀序列为模 板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链， 经过30个循环左右，目的片段得到大量扩增。本发明采用PrimerPremier5软件设计引 物，对粒重相关候选基因进行克隆。
[0033] 本发明的有益效果；
[0034] 利用简化基因组测序技术，鉴定出与小麦粒重紧密关联的候选区域，并克隆了该 区域的候选基因，经人工群体和自然群体联合验证，该基因是一种对粒重影响显著的新的 主效基因，并开发了功能标记（TaTGW-7A)。经生物信息学分析，该基因为嘲噪-3-甘油磯酸 合酶（IGP巧，是生长素色氨酸合成途径和非色氨酸合成途径的关键酶，直接影响生长素的 合成，从而进一步影响粒重的形成。本发明为小麦高产育种提供了新的基因资源，同时进一 步阐明了产量形成的分子机制。
【附图说明】
[0035] 图1为京411和红芒春21观察记带示意图；（1;京411 ;2;红芒春21;a;酶切之 前；b;酶切之后）
[0036] 图2为化TGW-7A的遗传定位的示意图；（红线、绿线、藍线分别代表2011、2012、 2014年粒重数据，LOD值取3. 0)
【具体实施方式】
[0037] 下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[00測（一）小麦基因组DNA提取
[0039] 用于DNA提取的试验材料为亲本京411和红芒春21、两个高低混池、重组自交系 RIL(京411/红芒春21)Fg群体各家系、256份种质资源材料。具体方法为；
[0040] 1、将小麦单巧粒磨碎，取0.Ig加入0. 7血SDS提取液（0. 1MTris-HCl(PH= 8. 5)， 0. 1M化C1，0. 05M邸TA(PH= 8. 0) ,2%SD巧在60°C恒温下裂解45min，其间多次震荡。
[0041] 2、在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin。
[0042] 3、取上清液加入等体积的酪；氯仿；异戊醇（25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很 快分层。
[0043] 4、在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin。
[0044] 5、取上清液加入等体积的酪；氯仿；异戊醇（25:24:1)上下颠倒旋转数次。
[0045] 6、在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin。
[0046] 7、取上清液加入等体积的异丙醇于-20°C冰箱静置30min。
[0047] 8、在 4°C12000巧m条件下，离屯、lOmin。
[0048]9、用70%的己醇洗漆两次。
[0049] 10、在 4°C12000;rpm条件下，离屯、lOmin。
[0050] 11、沉淀自然风干，4°C存，备用。
[0化1](二）简化基因组测序和酶切方案设计
[0052] 1、参考基因组确定：根据小麦的基因组大小W及GC含量等信息，最终选取小麦A 基因组作为参考基因组进行酶切预测。
[0053] 2、酶切方案确定；利用酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切 方案。
[0054] 3、实验流程；根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA用限制 性内切酶化elll(New化glandBiol油S，肥B)，进行酶切。对得到的酶切片段（SLAF标签