一种转基因小麦b73-6-1的品系特异性定量pcr检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒及应用， 属于转基因作物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 转基因小麦是利用基因工程技术，将外源基因导入小麦基因中，经过筛选得到的 能够表达目的基因的小麦。转基因小麦B73-6-1是由基因枪将pHMW-H)x5 (携带高分子量 麦谷蛋白亚基HMW-GS基因，由自身胚乳特异启动子驱动）和PAHC25 (携带标记基因bar和 GUS基因，上游连接广谱ubiquitin启动子）两个质粒通过共转化转入普通小麦品种中，经 过筛选获得的表达外源基因HMW-GS、GUS和bar基因的纯合体转基因材料。目前，对于转基 因小麦B73-6-1检测方法的研究仅限于定性检测，而不能够定量PCR检测，同时定性检测灵 敏度不高，现有技术中缺少转基因小麦B73-6-1的定量PCR检测方法。
【发明内容】
[0003] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定 量PCR检测试剂盒，采用的技术方案如下；
[0004] 本发明的目的在于提供一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂 盒，包括B73-6-1品系的特异性引物和探针W及内源参照基因的引物和探针；所述B73-6-1 的品系特异性引物及探针是根据B73-6-1的5'端上游旁侧序列设计的；所述内源参照基 因是根据GAG56D小麦醇溶蛋白基因设计的。
[0005] 所述B73-6-1的5'端上游旁侧序列如SEQIDNO. 7所示。
[0006] 所述B73-6-1的品系特异性引物核巧酸序列如SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9所示， 探针的核巧酸序列如SEQIDNO. 10所示。
[0007] 所述内源参照基因的引物核巧酸序列如SEQIDNO. 11和SEQIDNO. 12所示，探 针的核巧酸序列如SEQIDNO. 13所示。
[000引所述试剂盒在转基因小麦B73-6-1品系的定量检测中的应用。
[0009] 优选地，所述应用，为利用核巧酸序列为SEQ ID NO. 8-10所示的B73-6-1的品系 特异性引物和探针W及SEQ ID NO. 11-13所示的内源参照基因的引物和探针进行PCR反 应，对转基因小麦B73-6-1进行特异性定量PCR检测。
[0010] 优选地，所述？〇?反应，条件为；预变性951：303;扩增951：53,601：313,40个循 环。
[0011] 优选地，所述PCR反应，每20yL定量扩增体系含有；待测样品DNA10化g，上游引 物和下游引物各0. 2yM，探针0. 4yM，化qman探针巧光染料1X，R0X参比染料1X，灭菌蒸 馈水补足至20yL。
[001引所述应用，具体步骤如下：
[001引 1)提取待测样品DM;
[0014] 2)W样品DM为模板，利用核巧酸序列为SEQIDNO. 8-10所示的B73-6-1的特 异性引物和探针进行巧光定量PCR反应；W内部参照基因为模板，利用核巧酸序列SEQID NO. 11-13所示的特异性内源参照基因的引物和探针进行巧光定量PCR反应；设置空白对 照；所述PCR反应条件为；预变性95°C30s;扩增95°C5s，60°C31s，40个循环；所述PCR反 应，每20yL定量扩增体系含有；待测样品DNAl(K)ng，上游引物和下游引物各0. 2yM，探针 0. 4yM，化qman探针巧光染料1X，R0X参比染料1X，灭菌蒸馈水补足至20yL。
[001引本发明有益效果；
[0016] 本发明通过分析外源基因HM-GS基因的旁侧序列，设计引物进行品系特异性定 性和定量PCR检测方法的建立。本发明方法既能够定性，又能够定量，并且准确度好，灵敏 度高，检测灵敏度可达0. 01 %，品系特异性好。
【附图说明】
[0017] 图1为B73-6-1转基因小麦基因组用Pst I、Dra I、Pvu I和EcoR V酶切检测结 果；
[0018] (1，DL2000DNA分子量标准；2,Pst I;3, DraI;4, Pvu I;5, EcoRV)。
[0019] 图2为B73-6-1转基因小麦中质粒pHMW-lD巧在基因组上的整合图谱。
[0020] 图3结果；
[0021] (M，DL2000DNA分子量标准；1，HMW-GS5'上游旁侧序列扩增片段）。
[0022] 图4B73-6-1转基因小麦5'端上游旁侧序列Blast比对结果。
[002引图5B73-6-1品系特异性定量PCR产物位置图示；
[0024] (M，DL2000DNA分子量标准；1，B73-6-1品系特异性定量PCR引物位置）。
[0025] 图6标准品中GAG56D基因扩增曲线、标准曲线；
[0026] (A，标准曲线；B，扩增曲线）。
[0027] 图7标准品中B73-6-1外源基因的扩增曲线、标准曲线；
[0028] (A，标准曲线；B，扩增曲线）。
[0029] 图8不同转基因作物内参基因扩增检测结果；
[0030](1，DL2000DNA marker ;2-4为小麦内参基因GAG5抓引物扩增非转基因小麦、转基 因小麦B73-6-1、转基因小麦B72-8-1的检测结果（目的片段大小为319bp) ;5-7为玉米内 参基因zSSIIb引物扩增转基因玉米化176、M0N810、M0N863的检测结果（目的片段大小为 88bp) ;8-10为大豆内参基因lectin引物扩增转基因大豆GTS40-3-2、M0N89788、A2704-12 的检测结果（目的片段大小为118bp) 为水稻内参基因SPS引物扩增转基因水稻 TT51、抗虫水稻科丰6号、非转基因水稻的检测结果（目的片段大小为27化P);14-16为棉 花内参基因sadl引物扩增转基因棉花M0N53UM0N1445、化C0TT0N25的检测结果（目的片 段大小为10化P);17-19为油菜内参基因HMYG引物扩增转基因油菜MSI、MS8、RF1的检测 结果（目的片段大小为20化P))。
[003。图9B73-6-1品系特异性定量PCR检测方法的特异性测定。
[0032]图10B73-6-1品系特异性定量PCR检测方法的灵敏度测定。
[003引图11 6种小麦的定量PCR扩增结果。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0035] 实施例1 ;
[0036] 1转基因小麦B73-6-1外源基因旁侧序列分析
[0037] 1. 1DNA提取
[0038] 将转基因小麦B73-6-1和非转基因小麦按质量百分比混合，制成八个不同转基因 含量（1〇%、5%、2%、1%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、0. 01% )的样品。称取lOOmg于研磨成 粉末状的样品材料，使用植物DNA提取试剂盒提取样品总DNA。提取的总DNA溶于100yL dd&O中，经NanoDrop2000(ThermoScientific,美国）紫外分光光度计测定其浓度，最终 稀释成10化g/yL备用。用紫外分光光度计测定DNA溶液的0D260与0D280,并计算0D260/ 0D280的比值来评价提取的质量，本研究中所用DNA其0D比值均在1. 9左右。
[0039] 1. 2DNA文库构建
[0040] 转基因小麦基因组建库所用试剂盒为Clontech Genome Wa化erTM Universal Kit,其操作流程参照说明书。
[0041] 1. 2. 1 酶切
[004引具体操作如下：取2yg的基因组DNA分别用100U的Pst I、Dra I、Pvu I和EcoR V限制性内切酶酶切，总体积500uL于1. 5mL管中37°C过夜，直至基因组充分酶解；将酶切 消化的DNA片段用酪：氯仿（1 : 1)抽提2次，70 %酒精洗1次，沉淀后溶解在20yL的重 蒸水中，电泳检测酶切效果（如图1)，酶切产物需弥散且均匀分布用于构建文库进行染色 体步移分析。
[0043] 1. 2. 2酶切产物与接头连接
[0044] 将4化酶解DNA片段产物加入200化管中，然后加1.9化相对应的接头（序列 见表1)和1.6化10X连接缓冲液，接着加0.5化T4连接酶，16°C连接过夜。最后，连接 产物放置在7〇°C中5minW终止反应并加入72yL的重蒸水稀释W形成带接头的核基因组 酶解DNA片段文库。
[0045] 表1染色体步移所用接头及引物序列
[0046]
[0047] 1.3染色体步移引物设计
[0048]根据pHMW-lD巧质粒的结构，在其5'端上游设计了GSP1和GSP2引物（图2)，弓I 物相关信息如表2。
[0049] 表2染色体步移所用所有引物
[0050]
[005。1. 4染色体步移PCR扩增及测序
[005引1. 4. 1巢式PCR反应条件
[0053] 修饰接头连接PCR分为两轮巢式PCR反应。为了确保扩增的准确性和扩增长度， 采用Advantage 2Polymerase Mix聚合酶。
[0054]第一轮反应体系为 20yL，含 1XAdvantage2PCRBuffer, 0. 25mmol/LdNTPmix, 0.2ymol/LAPl和GSPl，lXAdvantage2PolymeraseMix，lyL连接DNA产物；反应条件； 7 个循环：变性 95°C25sec，退火 72°C3min;32 个循环：变性 94°C25sec，退火 67°C3min; 后延伸延伸67°C7min。
[00巧]第二轮反应体系同第一轮反应体系为20uL引