一种肺炎支原体核酸快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种肺炎支原体核酸快速检测方法。
【背景技术】
[0002]肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)，直径为125-150 nm，与黏液病毒的大小相仿，含DNA和RNA，缺乏细胞壁，呈球形、杆状、丝状等多种形态，革兰染色阴性。肺炎支原体(MP)是处于婴幼儿、青少年期容易出现的一种由于呼吸道感染而引发的一种主要危害其身体健康的病原体之一。目前市面上MP诊断方法主要包括经典的培养法、血清学体检测法和核酸检测方法等。分离培养法是诊断MP感染最可靠的方法，但MP分离培养需
3-4周，且灵敏度低、耗时长、技术要求高。血清学检测(包括冷凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标免疫斑点法和免疫荧光法等)需等到机体产生抗体后才能应用具有一定的滞后性。目前多用ELISA测定抗MP抗体，免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定的单克隆抗体，否则准确性不够，仅能作为辅助检测手段。因此能否提供快速、高敏、特异、简便、可靠、适合临床应用的检测技术已成为国内外研宄的重点。核酸检测常见的有核酸杂交试验和PCR技术，前者灵敏感度、特异度强，但需要应用较多的设备辅助，故难以推广，后者对检测MP DNA的灵敏度、特异度高，但因其程序相对复杂，对实验室环境要求高，荧光PCR方法设备昂贵等问题，也使得该技术推广进展缓慢。因此，寻找一种简便、快速、有效、适于基层推广的早期诊断方法非常重要。
【发明内容】
[0003]为解决上述问题，本发明提供了一种肺炎支原体核酸快速检测方法，检测方法步骤如下:
(1)样本处理，估计痰液样本的量，加入2-4倍体积的4%的NaOH溶液，充分混匀，室温静置液化10 min-20 min，使其充分液化；拭子样本直接保存于拭子保存液中；
(2)样本洗涤，取液化的痰液(或拭子冲洗液)样本转移到离心管中，离心去除上清液收集沉淀，用样本洗涤液洗涤沉淀，离心收集沉淀；
(3)核酸提取，用样本裂解液重悬上述沉淀，混匀，100°C温浴裂解5- 15 min，立即置于冰上，然后离心，上清液即为样本模板DNA ；
(4)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)上清液和阳性溶液；
(5)上机运行，将步骤(4)的实验管混匀后放入荧光读数仪，设定60- 65°C条下件保温30 -60 min;扩增体系中预先加入荧光染料，因扩增产物与荧光染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增读数判读结果；
(6)结果判读，如果仪器扩增读数呈“S”型或不完整“S”型，则结果判读为阳性；如果仪器扩增读数为“一”型，则结果判读为阴性。
[0004]在上述步骤中，结果判读时应依照阳性对照管仪器扩增读数呈“S”型，阴性对照管仪器扩增读数为呈“一”型，否则应判定该实验无效。
[0005]该发明的有益之处是:本发明试剂盒程序化了操作步骤，实现了对痰液和拭子样本中肺炎支原体的检测，使操作过程简便和可控，检测过程采用闭管检测同时又加入了稳定液防治气溶胶的形成，解决了污染问题，结果更可靠。本发明试剂盒因快速、高敏、操作简单、成本低等优点适合检测现场和基层医疗机构推广应用。
【具体实施方式】
[0006]下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述:
本发明方法的技术方案是:本发明提供了一种肺炎支原体核酸快速检测方法，检测方法步骤如下:
(1)样本处理，估计痰液样本的量，加入2-4倍体积的4%的NaOH溶液，充分混匀，室温静置液化10 min-20 min，使其充分液化；拭子样本直接保存于拭子保存液中；
(2)样本洗涤，取液化的痰液(或拭子冲洗液)样本转移到离心管中，离心去除上清液收集沉淀，用样本洗涤液洗涤沉淀，离心收集沉淀；
(3)核酸提取，用样本裂解液重悬上述沉淀，混匀，100°C温浴裂解5- 15 min，立即置于冰上，然后离心，上清液即为样本模板DNA ；
(4)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)上清液和阳性溶液；
(5)上机运行，将步骤(4)的实验管混匀后放入荧光读数仪，设定60- 65°C条下件保温30 -60 min;扩增体系中预先加入荧光染料，因扩增产物与荧光染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增读数判读结果；
(6)结果判读，如果仪器扩增读数呈“S”型或不完整“S”型，则结果判读为阳性；如果仪器扩增读数呈“一”型，则结果判读为阴性。
[0007]在上述步骤中，结果判读时应依照阳性对照管仪器扩增读数呈“S”型，阴性对照管仪器扩增读数呈“一”型，否则应判定该实验无效。
[0008]本发明中试剂盒使用的恒温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，可在15-60分钟内实现19-1Oltl倍的扩增，扩增体系中预先加入荧光染料，因扩增产物与荧光染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增读数判读结果，从而实现对样本中肺炎支原体的测定，具有简单、快速、特异性强的特点。本试剂盒利用恒温扩增技术，选取肺炎支原体基因保守区的六个不同的区域，设计4条引物，结合具有链置换功能的DNA聚合酶，实现核酸恒温扩增，扩增产物与荧光染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增曲线判读结果，从而实现对样本中肺炎支原体的测定。
[0009]本发明试剂盒程序化了操作步骤，实现了对痰液和拭子样本中肺炎支原体的检测，使操作过程简便和可控，检测过程采用闭管检测同时又加入了稳定液防治气溶胶的形成，解决了污染问题，结果更可靠。本发明试剂盒因快速、高敏、操作简单、成本低等优点，适合检测现场和基层医疗机构推广应用。
【主权项】
1.一种肺炎支原体核酸快速检测方法，其特征是:检测方法步骤如下: (1)样本处理，估计痰液样本的量，加入2-4倍体积的4%的NaOH溶液，充分混匀，室温静置液化10 min-20 min，使其充分液化；拭子样本直接保存于拭子保存液中； (2)样本洗涤，取液化的痰液(或拭子冲洗液)样本转移到离心管中，离心去除上清液收集沉淀，用样本洗涤液洗涤沉淀，离心收集沉淀； (3)核酸提取，用样本裂解液重悬上述沉淀，混匀，100°C温浴裂解5- 15 min，立即置于冰上，然后离心，上清液即为样本模板DNA ； (4)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)取得的上清液和阳性溶液； (5)上机运行，将步骤(4)的检测管混匀后放入荧光读数仪，设定60- 65°C条件下保温30 -60 min;扩增体系中预先加入荧光染料，扩增产物与荧光染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增读数判读结果； (6)结果判读，如果仪器扩增读数呈“S”型或不完整“S”型，则结果判读为阳性；如果仪器扩增读数为“一”型，则结果判读为阴性。2.根据权利要求1所述的一种肺炎支原体核酸快速检测方法，其特征是:所述的结果判读步骤6中，应依照阳性对照管扩增反应仪器读数呈“S”型，阴性对照管扩增反应仪器读数呈“一”型，否则应判定该实验无效。
【专利摘要】本发明提供了一种肺炎支原体核酸快速检测方法，利用恒温扩增技术，选取肺炎支原体基因保守区的六个不同的区域，设计4条引物，结合具有链置换功能的DNA聚合酶，实现核酸恒温扩增，扩增产物与荧光染料结合后会发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增曲线判读结果，从而实现对样本中肺炎支原体的测定。本发明试剂盒程序化了操作步骤，实现了对痰液和拭子样本中肺炎支原体的检测，使操作过程简便和可控，检测过程采用闭管检测同时又加入了稳定液防治气溶胶的形成，解决了污染问题，结果更可靠。本发明试剂盒因快速、高敏、操作简单、成本低等优点适合检测现场和基层医疗机构推广应用。
【IPC分类】C12R1/35, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN104988237
【申请号】CN201510436255
【发明人】杨帆, 綦洪敏, 邱青芳, 綦松妮, 刘晓娟
【申请人】青岛汉唐生物科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月23日