本发明涉及一种山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基及其制备方法，属于兽医生物学技术领域。
背景技术：
山羊传染性胸膜肺炎只发生于山羊，多感染3岁以下的山羊，具有显著的地方流行性，阴雨连绵、寒冷潮湿、羊群密集、拥挤等应激均能诱发本病。旧疫区发病的季节主要是冬季和早春枯草季节羊只营养缺乏，机体抵抗力降低；新疫区的发病，主要原因是引进病羊或带菌羊，伴随运输应激、饲养管理环境改变、草料更换、气候和水土差异等导致的群体发病。山羊传染性胸膜肺炎公认的病原体为山羊支原体肺炎亚种，该病原是一种能独立生活的原核生物，为丝状支原体族的一员，主要存在于病羊的肺组织、胸膜渗出物及纵膈淋巴结中。山羊支原体肺炎亚种对营养要求严格，在初次分离时生长缓慢，在临床病员分离时常常被环境中的精氨酸支原体和支原体绵羊肺炎亚种的生长所掩盖，无法分离到所需的目标支原体。在实际生产过程中，山羊传染性胸膜肺炎典型症状山羊病料的病原支原体的分离率极低，甚至由于精氨酸支原体和支原体绵羊肺炎亚种等病原微生物的污染低至1-5％，亟待一种新的实验方案解决山羊支原体肺炎亚种的分离问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种适合山羊支原体肺炎亚种生长，生长快、活菌滴度相对较高且能够抑制精氨酸支原体和支原体绵羊肺炎亚种生长的山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基，使用该选择性分离培养基用于临床分离培养山羊支原体肺炎亚种，可以提高分离过程中支原体生长速度，山羊支原体肺炎亚种的分离率高达80％以上，特异性和敏感性显著提高，用于山羊支原体肺炎亚种分离培养、生化特征、遗传、免疫等方面的研究。本发明的技术方案如下：
一种山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基，其主要成分为水解乳蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、MEM培养基、PPLO肉汤粉、丙酮酸钠、1％酚红溶液、特异性生长抑制血清和去离子水；
所述特异性生长抑制血清为绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清与精氨酸支原体特异性生长抑制血清等体积混合。
进一步的，10L本发明选择性分离培养基中，包括水解乳蛋白15-40g、酵母浸粉40-60g、葡萄糖15-30g、MEM培养基5-15g、PPLO肉汤粉10-20g、丙酮酸钠10-30g、1％酚红溶液(质量分数)10-20mL、健康马血清1-2L、特异性生长抑制血清10-30mL、去离子水调整至10L；
所述特异性生长抑制血清为绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清与精氨酸支原体特异性生长抑制血清等体积混合。
本发明中，特异性生长抑制血清的制备工艺如下：
绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清的制备：
利用绵羊肺炎亚种支原体培养物免疫新西兰白兔，获得生长抑制效价不低于26的绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清，即得。
精氨酸支原体特异性生长抑制血清的制备：
利用精氨酸支原体培养物免疫新西兰白兔，获得生长抑制效价不低于26的精氨酸支原体特异性生长抑制血清，即得。
将上述绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清和精氨酸支原体特异性生长抑制血清等体积混合，过滤除菌后备用，即得特异性生长抑制血清。
优选的，10L本发明选择性分离培养基中，包括水解乳蛋白20g、酵母浸粉55g、葡萄糖20g、MEM培养基12g、PPLO肉汤粉18g、丙酮酸钠15g、1％酚红溶液15mL、健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清20ml、去离子水调整至10L。
本发明还包括山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基的制备方法，10L选择性分离培养基来计，具体步骤如下：
按配比称取水解乳蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、MEM培养基、PPLO肉汤粉、丙酮酸钠、1％酚红溶液，溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，使用去离子水调整至8480mL,用0.45μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
使用前，加入健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清20mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH为7.6-7.8，优选的，pH为7.7，使用过滤除菌去离子水适量调整至总体积10L，即得山羊支原体肺炎亚种选择性分离液体培养基。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基用于临床分离培养山羊支原体肺炎亚种，提高了分离过程中支原体的生长速度，提高了山羊支原体肺炎亚种的分离率，分离率为80％以上。本发明不仅可用于山羊支原体肺炎亚种的快速分离鉴定，又可用于动物疫苗企业山羊支原体肺炎亚种菌种的制备与纯化。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基及其制备方法
选择性分离培养基的组成：水解乳蛋白20g、酵母浸粉55g、葡萄糖20g、MEM培养基12g、PPLO肉汤粉18g、丙酮酸钠15g、1％酚红溶液15mL、健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清20ml、去离子水调整至10L；
特异性生长抑制血清的制备工艺如下：
绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清的制备：
利用绵羊肺炎亚种支原体培养物免疫新西兰白兔，获得生长抑制效价不低于26的绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清，即得。
精氨酸支原体特异性生长抑制血清的制备流程：
利用精氨酸支原体培养物免疫新西兰白兔，获得生长抑制效价不低于26的精氨酸支原体特异性生长抑制血清，即得。
将上述绵羊肺炎亚种支原体特异性生长抑制血清和精氨酸支原体特异性生长抑制血清等体积混合，过滤除菌后备用，即得特异性生长抑制血清。
上述山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基的制备方法，具体步骤如下：
按配比称取水解乳蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、MEM培养基、PPLO肉汤粉、丙酮酸钠、1％酚红溶液，溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，使用去离子水调整至8480mL,用0.45μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
使用前，加入健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清20mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.7，使用过滤除菌去离子水适量调整至总体积10L，即得山羊支原体肺炎亚种选择性分离液体培养基。
实施例2山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基及其制备方法
选择性分离培养基的组成：水解乳蛋白15g、酵母浸粉55g、葡萄糖15g、MEM培养基15g、PPLO肉汤粉20g、丙酮酸钠12g、1％酚红溶液15mL、健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清20ml、去离子水调整至10L。
特异性生长抑制血清及山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基的制备方法同实施例1。
实施例3山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基及其制备方法
选择性分离培养基的组成：水解乳蛋白35g、酵母浸粉40g、葡萄糖20g、MEM培养基15g、PPLO肉汤粉15g、丙酮酸钠20g、1％酚红溶液18mL、健康马血清1800mL、特异性生长抑制血清20ml、去离子水调整至10L。
特异性生长抑制血清及山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基的制备方法同实施例1。
试验例1本发明山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基的应用
对实施例1、实施例2和实施例3中的山羊支原体肺炎亚种选择性分离培养基进行应用，以PPLO培养基、Hayflick’s培养基作为对照。以PCR方法检测山羊支原体肺炎亚种感染阳性的47份病料为研究对象，使用上述的5种培养基进行了山羊支原体肺炎亚种病原分离鉴定，结果如表1所示：
表1