柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物培养技术，具体涉及到新的柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法。
【背景技术】
[0002]柱状黄杆菌(JUavotmctorium columnare)隶属于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科，是革兰氏阴性的能滑动的需氧杆菌。它是一种世界范围内流行的淡水鱼类的重要致病菌，其感染会导致鱼类出现烂鳃、体表溃疡、鳍条腐烂、出血等症状，称为柱形病。柱状黄杆菌严重危害我国重要经济鱼类，如草鱼、青鱼、鳜、鲤、鲫、团头鲂、鳗鲡、巨脂鲤、银鲈、鲑、鳟、白鲳、罗非鱼等。被感染的鱼类具有很高的死亡率，给渔业生产带来数以亿计的巨大经济损失，是我国重要的鱼类病原菌。我国很重视柱状黄杆菌的研究，目前主要集中细菌的快速鉴定和疫苗研发。如“一种检测无鳞鱼致病菌柱状黄菌的方法和检测试剂盒”(申请号:CN201010180832)。此专利采用PCR技术鉴定菌种，没有涉及到选择性培养基配方和柱状黄杆菌的分离纯化方法。“柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法”(申请号:CN201310478221)。此专利为柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，也没有涉及到选择性培养基配方和柱状黄杆菌的分离纯化方法。
[0003]在鱼类疾病的研究中，快速分离病原菌是从事疾病研究的首要环节。但是，目前还缺乏快速分离该菌的选择性培养基。在病原菌的分离过程中，只要有一个杂菌的存在，就会导致整个细菌分离的失败。因此，开展细菌的纯化技术研究是必须的。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于:它是在柱状黄杆菌常规培养基灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL,倒平板而得到的柱状黄杆菌选择性固体培养基；
或为在柱状黄杆菌常规培养基的配方中去除琼脂，灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL而得到的柱状黄杆菌选择性液体培养基。
[0006]按上述方案,所述的柱状黄杆菌常规培养基为常规Shieh固体培养基。
[0007]按上述方案，所述的常规Shieh固体培养基为:称取蛋白胨5 g、酵母提取物
0.5 g、Noble 琼脂 10 g、K2HPO4 0.1 g、KH2PO4 0.05 g、乙酸钠 0.01 g、NaHCO3 0.05 g、MgSO4.7H20 0.3 g、BaCl2.H2O 0.01 g、FeSO4.7H20 0.001 g、CaCl2.2H20 0.0067 g 加入到1000 mL蒸懼水中，调pH至7.2,灭菌而得。
[0008]按上述方案，所述的灭菌温度120°C，灭菌时间为20min。
[0009]本发明所要解决的技术问题之二是提供一种利用上述柱状黄杆菌选择性培养基分离纯化柱状黄杆菌的方法，步骤如下:
1)、在鱼类病灶上，采用无菌操作，将细菌通过划平板法接种到柱状黄杆菌常规固体培养基上进行培养，至培养基上观察到柱状黄杆菌的典型黄色菌落；
2)、挑选上述步骤培养得到的单一黄色菌落，划线接种到柱状黄杆菌选择性固体培养基上，进行培养
3)、挑选上述步骤培养得到的单一黄色菌落，再次接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，进行培养；
4)将上述步骤培养得到的黄色菌液按照10倍系列稀释，均匀涂布到状黄杆菌选择性固体培养基上，进行培养；
5)挑选最低稀释倍数出现细菌的平板上的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，进行培养，然后经确证为纯的柱状黄杆菌菌种后，进行低温保存或干燥保存，即得分离纯化后的柱状黄杆菌。
[0010]按上述方案，所述的培养为26-28°C培养24-26小时。
[0011]按上述方案，所述步骤4)中进行10倍系列稀释后得到稀释度为10_5~10_8的体系。
[0012]按上述方案，在进行一次选择分离后未能得到纯的柱状黄杆菌后，再重复步骤2)到步骤5)，直到获得纯的柱状黄杆菌菌种。
[0013]按上述方案，所述柱状黄杆菌的确证包括进行形态学实验，生理生化实验和细菌16S rDNA基因测序实验，基于形态学特征，生理生化特征和16S rDNA基因序列特征进行确证。
[0014]本发明的有益效果:
本发明提供的柱状黄杆菌选择性培养基，可以从环境和鱼类病灶中快速分离到柱状黄杆菌，为研究该细菌提供纯的菌种，由此便于柱状黄杆菌导致的相关疾病的研究。
[0015]【具体实施方式】:
以下结合实例对本发明的
【发明内容】
作进一步的描述:
实施例1:
柱状黄杆菌常规培养基为常规Shieh固体培养基。所述的常规Shieh固体培养基为:称取蛋白胨5 g、酵母提取物0.5 g、Noble琼脂10 g、K2HPO4 0.1 g、KH2PO4 0.05 g、乙酸钠 0.01 g、NaHCO3 0.05 g、MgSO4.7H20 0.3 g、BaCl2.H2O 0.01 g、FeSO4.7H20 0.001 g、CaCl2.2H20 0.0067 g加入到1000 mL蒸馏水中，调pH至7.2，灭菌而得。
[0016]柱状黄杆菌选择性固体培养基:在上述柱状黄杆菌常规培养基灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL，倒平板而得；
柱状黄杆菌选择性液体培养基:在上述柱状黄杆菌常规培养基的配方中去除琼脂，灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL而得。
[0017]黄颡鱼柱状黄杆菌的分离
1、取上述制备的柱状黄杆菌常规固体培养基、选择性固体培养基和选择性液体培养基，备用；
2、挑取病鱼黄颡鱼尾部病灶，划线接种到柱状黄杆菌常规固体培养基上，28°C培养48小时，培养基上可以观察到柱状黄杆菌的典型黄色菌落。
[0018]3、挑选上述培养得到的单一黄色菌落，划线接种到柱状黄杆菌选择性固体培养基上，在28°C培养48小时。
[0019]4、挑选上述培养得到的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，在28°C培养24小时；
5、将黄色菌液按照10倍系列稀释(稀释后稀释度为10_5~10_8)，均匀涂布到状黄杆菌选择性固体培养基上，在28 °C培养48小时；
6、挑选10_8稀释平板上的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，在28°C培养24小时，得到较纯培养物；
7、菌株确证:
用步骤6)得到的纯化菌液做革兰氏染色，细菌呈红色，形态单一。
[0020]收集步骤6)得到的纯化菌液，采用通用引物，做菌液PCR扩16S rDNA并测序，具体如下:
I)引物序列:27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ； 1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，27F序列如 SEQ ID NO:1 所示，1492R序列如 SEQ ID NO:2所示。
[0021]2)反应体系:菌液 I yL，27F:l μ L (10 μ M), 1492R:1 μ L (10 μ Μ), 2 X TaqMix (康为世纪公司):10 μ L, dd H2O:7 μ L。
[0022]3)反应程序:预变性 95 °C，5 min ;变性 95°C，30 s，退火 55°C，40 8，延伸，72°〇，2min, 35个循环；终止延伸72°C，10 min。
[0023]4)将扩增得到的DNA产物，直接送公司测序，获得下列测序结果(1409 bp),序列如 SEQ ID NO:3 所示:
TGTCGCGGCTACCATGCAGTCGAGGGGTAGAAGGAGCTTGCTCCTTTGAGACCGGCG