一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基及其配制方法

专利名称：一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基及其配制方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌的培养基及其制备方法，特别涉及一种适合工业化的双l技杆菌培养基。。
背景技术：
双歧杆菌(Bifidobactemim)是人畜等温rflL动物肠道内重要的生理性细菌之一，是人体健康的重要指 标菌之一，它在肠道菌群中所占比例直接影响着宿主的健康状况，与其它正常菌群一起构成了阻止外来菌 入侵的定植阻力，具有一定的生物拮抗作用，同时双歧杆菌体内含有大量的消化酶，能消化一些机体内依 靠本身的酶系不能消化的营养物质，促进体内营养物质的吸收，双歧杆菌及其表面结丰勾成分可作为生物应 答剂经口服或非胃肠途径增强宿主的免疫监视功能，可增强各种细胞因子和抗体的产生，提高NK和巨噬 细胞活性，提高局部或全身的防御功能，发挥自稳调节、抗感染、抗肿瘤效应。目前2又歧杆菌多作为益生 菌添加在乳品中，在欧美、日本等国家的功能性食品市场占统治地位，仅2005年就有379种益生菌产品 上市。
目前，双歧杆菌较常用的培养基有MRS、 NPNL、 TPY、 PTYG等。TPY和PTYG培养基缓冲能力较 弱，不适合大规模使用；MRS和NPNL营养成分丰富，缓冲能力强，但目前MRS和NPNL培养基存在如 下问题价格较高(NPNL13元/L、 MRS3元/L;缓冲体系中磷酸盐易造成乳酸杆菌由耐冻的短棒变成不 耐冻的纤棒状；较多无机盐成分对人体和动物健康具有潜在有害影响；L-十胱氨酸盐酸盐经高温灭菌产生 不愉快气味等问题限制其在工业上的应用。为了降低成本研究人员所筛选双歧杆菌培养基多是在生化培养 基的基础上添加一定比例的具有双歧增长因子的天然物质，如番茄汁、菊芋汁、胡萝卜汁等，也达到了提 高活菌数的目的，但是此类培养基配制步骤较多，操作繁琐，不适宜用于工业化。

发明内容
为克服现有技术中的上述不足，木发明提供了一种以玉米浆干粉为主要原料的双歧杆菌培养基。其具 有成本经济和易于配制的特点。
1双歧杆菌模板培养基筛选
为了对双歧杆菌的生长特性有一个初步的了解，选择了耐酸耐胆盐等性能较好的长双歧杆菌为实验菌 株，测定了长双歧杆菌在四种不同培养基下的生长曲线。采用25mL厌氧螺口试管，NPNL、 MRS、 TPY、 PTYG培养基，接种量1%, 37'C静置培养，每三小时取样，测定活菌数，对比菌株在不同培养基中的生 长速度和活菌数量。实验结果如附图1所示。由SAS统计分析可知，长双歧杆菌在NPNL培养基中的培养12h进入稳定期以后活菌数与其他培养 基相比均有显著性差异，因此选择NPNL为模板进行工业化培养基筛选。
NPNL培养基成分为蛋白胨10g，胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉10g，葡萄糖10g，牛肝 粉15g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，吐温一80 1ml，可溶性淀粉0.5g，牛肉膏3g，溶液A10ml，溶液B5ml。(其 中，A液K2HP04-25g, KH2P04 25g,蒸馏水250ml; B液MgS04'7H205g， FeS04'7H20 0.5g， NaCl 0.5g, MnS04'H20 0.337g，蒸馏水250ml) pH7.2。
2限制NPNL培养基工业化应用的因素
NPNL培养基组成成分包括碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肝 粉)、缓冲体系(K2HP04, KH2P(D4)、抗氧化剂(L-半胱氨酸盐酸盐)、微量元素(MgSO+7H20 、 FeS04-7H20、 NaCl 、 MnS04.H20)。
NPNL培养基中不同种类的营养素所占比例差别较大，如附图2。氮源成本占到全部成本的93%,碳 源占到2.5%，抗氧化剂占4.0%，缓冲体系、微量元素、乳化剂共占0.5%。由附图2可知，氮源成本较高 影响了NLNL培养基工业化应用。此外，磷酸盐缓冲液对菌体、较多无机盐成分对人和动物健康的有害影 响，以及L-半胱氨酸盐酸盐灭菌产生的不良风味均是限制NPNL培养基工业化应用的肉素。
3工业化培养基选择
针对NPNL的缺点进行工业培养基的筛选，在不降低双歧杆菌生物发酵量的前提下对模板NPNL培养 基进行迠当修改。
3.1氮源的确定
NPNL中氮源的成本占总成本的90%以上，因此降低培养基成本主要是降低氮源的成本。 选用较为常见且成本较低的脱脂奶粉、乳清蚩白、玉米浆等氮源进行研究，其他营养成分及用量均按
照模板NPNL培养基中的成分及用量进行添加。脱脂奶粉、乳清蛋白、玉米浆干粉等氮源的添加量为模板
NPNL培养基中粗蛋白质含量(25g/L)，测定长双歧杆菌在各种培养基中的活菌数，结果如附图3所示 在蛋白质含量均为25g/L的条件下，长双歧杆菌在9h进入稳定期，在玉米浆干粉中的活菌数比脱脂奶
粉和乳清蛋白屮的活菌数有显著性差异，和模板培养基NPNL没有显著性差异，因此选用玉米浆干粉作为氮源。
在碳源、抗氧化剂、乳化剂等其他条件都不变的情况下，选用不同玉米浆干粉蛋白质含量的培养基， 1%接种，12h进行活菌数测定，结果如附图4所示。
由SAS统计分析可知，长双歧杆菌在蛋Q质含量为22g/L和25g/L的培养基中活菌数均比其他含量的 培养基中活菌数有显著性差异，这两者没有显著性差异，因此在以玉米桨干粉作为培养基氮源时，优选培 养基的蛋白质含量为22 25g/L。可选择不同蛋白含量的玉米桨干粉作为氮源，并根据所需的培养基蛋白含量调节玉米桨干粉的添加 量。玉米浆干粉的蛋白含量优选为40重量％，其添加量可以为55~63g/L。
3.2缓冲体系的确定
玉米浆干粉培养基中具有较多的固形物，是一种良好的缓冲体系。设想可以取代磷酸盐缓冲体系起到 缓冲作用，并进行验证。在3.1筛选的培养基基础上分别添加和不'添加磷酸盐缓冲体系，1%接种，在12h 达到稳定期时分别取样，测定活菌数，添加磷酸盐缓冲体系的培养基活菌数对数值为9.61±0.03，不添加磷 酸盐缓冲体系的培养基活菌数对数值为9.65±0.05,经SAS统计分析可知两者没有显著性差异。
由结果可知，添加或者不添加磷酸盐缓沖体系对玉米浆培养基的pH及活菌数变化没有显著影响，能 起到缓冲的作用。因此可以剔除模板NPNL培养基中磷酸盐缓冲液，以避免其对菌体冻干存活率的影响。
3.3无机盐溶液的确定
有研究表明，在含有玉米浆成分的培养基中添加或者不添加外来无机盐成分对鼠李糖乳杆菌产乳酸能 力没有显著性差异，表明玉米浆中的无机盐含量可以满足乳酸菌对矿物盐的需求，可以略去NPNL培养基 中的无机盐溶液，并进行实验验证是否对双歧杆菌的生长有影响。在3.2筛选的培养基基础上分别添加和 不添加NPNL中的无机盐溶液，1%接种，12h达到稳定期是取样测定活菌数，添加NPNL中无机盐溶液的 培养基活脔数对数值为9.73±0.03，不添加NPNL中无机盐溶液的培养基活菌数为9.60±0.07。
经SAS统计分析可知两者没有显著性差异，即玉米浆中的无机盐成分已经能够满足双歧杆菌的生长， 因此在所选的玉米浆培养基中不必添加NPNL中的无机盐溶液。
3.4抗氧化剂的确定
有研究表明，抗坏血酸作为一种抗氧化剂也具有消除氧对双歧杆菌的胁迫作用且其在膜过滤除菌和双 歧杆菌培养过程中没有不良气味产生，因此可以考虑取代L-半胱氨酸盐酸盐，选用抗坏血酸作为抗氧化剂 添加到3.3所筛选的培养基中，1%接种，12h时取样测定活菌数，结果如附图5所示
其中，0表示不添加任何抗氧化剂。结果表明，添加不同量的抗坏血酸对双歧杆菌在玉米浆培养基中 的生长没有显著性影响，肉此可以不添加任何抗氧化剂.究其原因可能为，玉米浆中含有约0.39% (下物质 含量)的胱氨酸，而胱氨酸可以与半胱氨酸相互转化，在双歧杆菌发酵的过程中可以起到去除氧对菌体的 化学胁迫作用。
本发明以玉米桨作为双歧杆菌培养基的氮源。具有以下优势
玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素、无机盐等，含大约70%同体物质，蛋白质含量约 40%,氨基酸含量约20%，其营养结构很适合乳酸菌生长繁殖的需要。
其来源广泛，且经喷雾干燥制得的玉米浆干粉，储运方便，适应工业化大规模生产的需要。近年玉米淀粉生产增长较快，玉米浆的出路也成了问题，特别是玉米淀粉厂比较集中的产区，很多小 厂均将玉米浸泡水直接排放，浪费资源，且造成环境的污染。本发明开拓了玉米浆的使用范围。
其成本低廉，显著地降低了培养基的成分，相比NPNL培养基价格下降95。/。，相比MRS培养基价格 下降80%。
其制作过程简单，适合双歧杆菌的工业化规模生产。


附图1:双歧杆菌在四种双歧培养基中的生长曲线。 附图2: NPNL培养基中个营养成分的成本。
附图3:替换的三种氮源培养基培养双歧杆菌的结果。
附图4:不同卫米浆干粉蛋白质浓度培养基培养双歧杆菌的结果。
附图5:添加不同抗氧化剂的玉米浆干粉培养基中培养双歧杆菌的对比。
具体实施例方式
实施例1:
(1) 制备玉米浆称重玉米浆干粉后，补足水至55 63g/L，纱布过滤，备用；
(2) 添加葡萄糖，10 20g/L;吐温-80, 0 1g/L;
(3) 调节pH值至6.5 7.2;
(4) 110。C 12rC， 10 15min灭菌备用。 实施例2:
(1) 制备玉米桨选择经过喷雾干燥加工的精制玉米浆干粉，称重后，补足水至63g/L，调节pH值 到7.2， 8层纱布过滤，备用；
(2) 添加葡萄糖，10g/L;
(3) 调节pH值至6.5;
(4) 分装，110'C 121'C， 10 15min灭菌备用。
实施例3:
(1)制备玉米浆选择经过喷雾干燥加工的精制玉米浆干粉，称重后，补足水至58g/L，调节pH值到7.2， 8层纱布过滤，备用；
(2) 添加葡萄糖，15g/L;吐温-80, 0.5g/L;
(3) 调节pH值至7.0;
(4) 分装，110°C 121°C， 10 15min灭菌备用。 实施例4:
(1) 制备玉米浆选择经过喷雾千燥加T的精制玉米浆干粉，称重后，补足水至55g/L，调节pH值 到7.2， 8层纱布过滤，备用；
(2) 添加葡萄糖，20g/L;吐温-80， lg/L;
(3) 调节pH值至7.2;
(4) 分装，110'C 12rC， 10 15min灭菌备用。
权利要求
1.一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基，其特征在于由以下成分组成以玉米浆干粉为氮源使培养基蛋白质含量为22～25g/L；葡萄糖，10～20g/L；吐温-80，0～1g/L；初始pH 6.5～7.2，余量为水。
2. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于其中玉米浆千粉的蛋白质重量含量为40%。
3. 根据权利要求书1或2所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基，其特征在于所述玉米浆干粉是经 过喷雾下燥加工的精制玉米浆千粉。
4. 根据权利要求书1或2所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基，其特征在于所述葡萄糖是分析纯葡萄糖。
5. 根据权利要求书1或2所述的适合「.业化生产双歧杆菌培养基，其特征在于所述吐温-80是分析纯 吐温-80。
6. 根据权利要求书l一5所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 制备玉米浆称重玉米浆干粉后，补足水至规定浓度，纱布过滤后，备用；(2) 在步骤(O的玉米浆中添加规定量的葡萄糖和/或吐温-80;(3) 调节pH值至6.5 7.2;(4) 110。C 12rC，灭菌10 15min即得。
全文摘要
本发明公开了一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基及其配制方法。所述培养基由以下成分组成玉米浆干粉(蛋白含量40％)，55～63g/L；葡萄糖，5～10g/L；吐温-80，0～1g/L；初始pH 6.5～7.2。长双歧杆菌BBMN68及BB12在该培养基中生长良好，最大生长量达到10⁹cfu/ml，优于经典双歧杆菌培养基MRS及NPNL。该培养基成本低廉(相比NPNL培养基价格下降95％，相比MRS培养基价格下降80％)，制作过程简单，适合双歧杆菌的工业化规模生产。
文档编号C12R1/01GK101597585SQ20091013651
公开日2009年12月9日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者任发政, 刘松玲, 刘爱萍, 张丁丁, 杨海莺, 田寒友, 蒋菁莉, 亮 赵 申请人:任发政