专利名称：一种双歧杆菌发酵用复合培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌发酵用复合培养基，属于食品及食品添加剂生产技术领域。
背景技术：
双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种人体肠道中重要的生理性细菌。关于双歧杆菌的生理调节作用已被大量研究所证实。从20世纪70年代起，双歧杆菌制品开始蓬勃发展，至今势头强劲。由于各种双歧杆菌制品的生产离不开双歧杆菌的培养，因此，研究双歧杆菌的高效、廉价发酵培养基是生产双歧杆菌制剂的关键问题。在现有技术中，双歧杆菌培养基是以MRS培养基或改良MRS培养基进行发酵培养，MRS培养基培养双歧杆菌效果较好，菌体生长繁殖快，菌体浓度可达到109/ml，但存在的问题是MRS培养基价格高，不适宜规模生产引用，这也是制约双歧杆菌功能性制剂生产的主要因素。寻找一种价格低、培养时间短的双歧杆菌的培养基成为业内迫切需要解决的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种双歧杆菌发酵用复合培养基，双歧杆菌在其中生长良好，发酵液可直接用于生产功能性食品，从而实现了双歧杆菌廉价、高效培养。
本发明的目的是基于以下构思实现的。大量科学实验和生产实践证明双歧杆菌的培养需要较高的营养环境，这是在寻找适合双歧杆菌生长的培养基时首先要考虑的因素，即培养基中应含有较高的营养成分，此外，它应该适合大规模工业化生产，特别是成本要低。本发明人经过多年研究发现菊芋是比较合适的原料。菊芋(Jerusalem artichoke)，俗名洋姜，它分布广，适应性强，种植简易，产量极高。菊芋淀粉是β2，1连接的多聚果糖淀粉对双歧杆菌的生长具有选择性生长优势。分析据测定表明，鲜菊芋茎中含79.8％，碳水化合物(菊粉)16.6％，蛋白质1.0％，粗纤维0.6％，灰分2.8％及一定量的维生素，其中碳水化合物的78％为菊糖。研究表明，菊糖有许多生理功能，特别是能选择性促进双歧杆菌的生长。迄今为止，我国对菊芋的开发还不能令人满意，菊芋基本上还只是用于腌制咸菜。由此可见，菊芋是一种极具开发潜力的半野生资源。本发明是在大量有关基础研究的基础上，以菊芋得以综合利用和双歧杆菌制剂开发为目标的系统研究，取得了突破性研究成果，为双歧杆菌活菌制剂的生产研制出了一种高效、廉价的菊芋汁复合培养基，同时该培养基的使用也能进一步推动菊芋资源的开发利用。
为了确定菊芋汁复合培养基的组成，发明人做了以下工作第一考察了双歧杆菌在菊芋汁中的生长状况。
为了设计以菊芋汁为主要原料的双歧杆菌培养基，首先对双歧杆菌在纯菊芋汁中的生长进行了系统研究。将Blr(长双歧杆菌)、Bbm(两歧双歧杆菌)活化后，以0.1％接种量接种到菊芋汁中，37℃恒温培养，定时取样，进行活菌数测定。结果为Blm(长双歧杆菌)和Bbm(两歧双歧杆菌)在菊芋汁中能够良好生长，在12h达到生长高峰。Blm(长双歧杆菌)的最大生长量为2.360×108cfu/mL，Bbm(两歧双歧杆菌)的最大生长量为1.000×108cfu/mL。由于双歧杆菌的生长对营养要求很高，上述结果表明菊芋汁中的营养成分比较适合双歧杆菌生长，可以作为筛选优化的初始培养基。Blm(长双歧杆菌)和Bbm(两歧双歧杆菌)在菊芋汁中的生长曲线见附图1。
第二考察了在菊芋汁中添加不同物质对双歧杆菌生长的影响。参考经典双歧杆菌培养基的配方，在菊芋汁中分别加入各种物质成分，研究它们对菊芋汁的营养补充效果，为筛选优化培养基做进一步的准备。将Blm(长双歧杆菌)、Bbm(两歧双歧杆菌)活化后，以0.1％接种量分别接种到不同处理的菊芋汁中，37℃恒温培养12h，取样进行活菌数测定。结果为在菊芋汁中添加胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、半胱氨酸盐酸盐、大豆蛋白胨对Blm(长双歧杆菌)、Bbm(两歧双歧杆菌)促进生长作用极显著。在菊芋汁中添加吐温80、磷酸氢二钾对Blm(长双歧杆菌)、Bbm(两歧双歧杆菌)促进生长作用显著。实验结果见表1和表2。
表1.Blm(长双歧杆菌)在添加不同成分的菊芋汁中的生长状况培养基 活菌数(cfu/mL) 方差分析(p)促进作用JAJ 1.560×108JAJ+胰蛋白胨(1％) 4.039×108＜0.01 +JAJ+牛肉膏(1％) 5.559×108＜0.01 +JAJ+酵母膏(0.5％) 1.037×108＜0.05 -JAJ+葡萄糖(2％) 1.981×107＜0.01 -JAJ+吐温80(0.1％) 2.482×108＜0.05 +JAJ+磷酸氢二钾(0.2％) 2.641×108＜0.05 +JAJ+乙酸钠(0.5％) 1.800×103＞0.05 +JAJ+柠檬酸铵(0.2％) 2.318×108＞0.05 +JAJ+硫酸镁(0.02％) 1.512×108＞0.05 -JAJ+硫酸锰(0.02％) 2.182×108＞0.05 +JAJ+玉米浆(0.3％) 5.824×108＜0.01 +JAJ+Cys-HCl(0.05％) 5.249×108＜0.01 +JAJ+乳糖(1％) 1.181×107＜0.01 -JAJ+氯化钠(0.2％) 1.794×108＞0.05 +JAJ+磷酸二氢钾(0.1％) 1.206×108＞0.05 -JAJ+大豆蛋白胨(0.05％) 5.249×108＜0.01 +JAJ+可溶性淀粉(0.05％) 1.824×108＞0.05 +
表2.Bbm(两歧双歧杆菌)在添加不同成分的菊芋汁中的生长状况培养基 活菌数(cfu/mL) 方差分析(p) 促进作用JAJ 1.000×108JAJ+蛋白胨(1％) 3.539×108＜0.01 +JAJ+牛肉膏(1％) 4.580×108＜0.01 +JAJ+酵母膏(0.5％)6.590×107＜0.05 -JAJ+葡萄糖(2％) 2.680×107＜0.01 -JAJ+吐温80(0.1％)2.620×108＜0.05 +JAJ+磷酸氢二钾(0.2％)2.045×108＜0.05 +JAJ+乙酸钠(0.5％)3.390×107＜0.05 -JAJ+柠檬酸铵(0.2％) 4.680×107＜0.05 -JAJ+硫酸镁(0.02％) 2.110×108＞0.05 +JAJ+硫酸锰(0.02％) 2.900×107＜0.05 -JAJ+玉米浆(0.3％)5.003×108＜0.01 +JAJ+Cys-HCl(0.05％) 4.489×108＜0.01 +JAJ+乳糖(1％)1.270×107＜0.01 -JAJ+氯化钠(0.2％)2.200×108＞0.05 +JAJ+磷酸二氢钾(0.1％)9.520×107＞0.05 -JAJ+大豆蛋白胨(0.05％) 4.975×108＜0.01 +JAJ+可溶性淀粉(0.05％) 9.790×107＞0.05 -注“+”表示有促进作用“-”表示有抑制作用。
第三筛选优化菊芋汁复合培养基，采用正交试验法确定菊芋汁复合培养基的最佳配方组成。
综合上述结果，并考虑到成本因素，确定将玉米浆、半胱氨酸盐酸盐和大豆蛋白胨这三种成分补充到菊芋汁中；在对三因素多水平的单因子试验的基础上，设计正交试验对菊芋汁复合培养基进行筛选优化。本试验采用L9(33)正交表.
首先选择Blm(长双歧杆菌)一个菌株作正交试验菌株。将Blm(长双歧杆菌)活化后，以0.1％的接种量接种到各个培养基中，37℃恒温培养12h，进行活菌数测定。结果为在参加试验的9个组合处理中，第5号组合是最优组合，即A2B2C3。为了寻找理论上的最优处理组合，根据数据分析结果作三个因素不同水平与试验指标的关系图，结果为A2、B2、C1分别是三个因素的最佳水平。三因素不同水平与试验指标的关系见图2所示。
在得到比较理想的培养基组成后，再用其它双歧杆菌菌株进行检验。将Blm(长双歧杆菌)、Bbm(两歧双歧杆菌)、Blr(长双歧杆菌)和Bbb(两歧双歧杆菌)活化后，以0.1％接种量接入A2B2C1和A2B2C3两个组合的培养基中，37℃恒温培养12h，取样测定活菌数。结果为4个菌株在两个培养基中的活菌数都可以达到109以上，A2B2C1稍优于A2B3C1，即在菊芋汁中补充0.05％玉米浆、0.05％大豆蛋白胨和0.025％半胱氨酸盐酸盐可以使双歧杆菌生长最好。
经以上试验得出双歧杆菌发酵用复合培养基的组成可以表示为菊芋汁 1000ml玉米浆 1-5ml大豆蛋白陈 0.25-0.75g半胱氨酸盐酸盐 0.25-0.75g更合适的配方组成为菊芋汁 1000ml玉米浆 3ml大豆蛋白陈 0.5g半胱氨酸盐酸盐 0.25g试验结果列表如下表3.正交试验的因素和水平表
表4.正交试验方案和结果分析表因素试验号活菌数(lgcfu/mL)A B C1 A1 B1 C19.0762 A1 B2 C29.0453 A1 B3 C39.0094 A2 B1 C29.0395 A2 B2 C39.1016 A2 B3 C19.0877 A3 B1 C38.8758 A3 B2 C18.9969 A3 B3 C28.986M127.13 26.99 27.159M227.227 27.142 27.07M326.857 27.082 26.985m19.043 8.997 9.053
m29.0769.0479.023m38.9529.0278.995R 0.1240.05 0.058表5.双歧杆菌在两种培养基中的生长状况比较菌株 A2B2C1(cfu/mL) A2B3C1(cfu/mL) 方差分析(p)Blm1.400×1091.125×109＞0.05Bbm1.250×1091.020×109＞0.05Bbb1.300×1091.000×109＞0.05Blr1.350×1091.150×109＞0.05表中Blm、Blr为长双歧杆菌，Bbm、Bbb为两歧双歧杆菌。
本发明所述的双歧杆菌发酵用复合培养基的制备方法包括以下步骤(1)制备标准菊芋汁a.使用当年采集或低温-20℃保存的菊芋，用水清洗干净；b.菊芋称重后放在水浴锅内，加水升温至100℃，灭酶，时间5-10分钟；c.将菊芋粉碎成菊芋粉，加适量70-85℃水，用100目双层滤布过滤，取滤汁，滤渣加70-85℃水适量，重复压榨，合并滤液；d.取上述的合并滤液，加水定容，控制量为100g菊芋制得100ml标准菊芋汁；(2)制备复合培养基在制得的标准菊芋汁中添加配合量的玉米浆、大豆蛋白陈和半胱氨酸盐酸盐即得成品双歧杆菌发酵用复合培养基。
本发明取得的技术进步在于双歧杆菌在该培养基中生长良好，最大生长量达到109cfu/mL以上，和实验室中所使用的经典的双歧杆菌培养基(如MRS)相当；该培养基的主要原料菊芋价廉易得，其他补充成分种类少、用量小，因此生产工艺流程简单，成本低廉，适宜双歧杆菌的工业化大规模培养。
图1是Blm(长双歧杆菌)和Bbm(两歧双歧杆菌)在菊芋汁中的生长曲线图。
图2是三因素不同水平与试验指标的关系图。
具体实施例方式
以下实施例用以说明本发明。
实施例1双歧杆菌发酵用复合培养基的组成为菊芋汁 1000ml玉米浆 1ml大豆蛋白陈 0.75g半胱氨酸盐酸盐 0.25g双歧杆菌发酵用复合培养基的制备(1)制备标准菊芋汁a.使用11月下旬采收的菊芋，用水清洗干净；b.称取菊芋1000g放在水浴锅内，升温到100℃，灭酶，5分钟后结束；c.将菊芋粉碎成菊芋粉，加80℃水500ml，用100目双层滤布过滤，取滤汁，滤渣加80℃水200ml，重复压榨、浸提三次，合并滤液约950ml；d.取上述的合并滤液，加水50ml制得1000ml标准菊芋汁；(2)制备复合培养基在制得的标准菊芋汁中添加配合量的玉米浆、大豆蛋白陈和半胱氨酸盐酸盐即得成品双歧杆菌发酵用复合培养基。
实施例2双歧杆菌发酵用复合培养基的组成为菊芋汁 1000ml玉米浆 3ml大豆蛋白陈 0.5g
半胱氨酸盐酸 0.25g双歧杆菌发酵用复合培养基的制备(1)制备标准菊芋汁a.使用低温-20℃保存的菊芋，用水清洗干净；b.称取菊芋1000g放在水浴锅内，加水升温到100℃，灭酶8分钟；c.取出菊芋，将其粉碎成菊芋粉，加入85℃水500ml，用100目双层滤布过滤，取滤汁，滤渣加85℃水250ml，重复压榨、浸提三次，合并滤液960ml；d.取上述的合并滤液，加入40ml清水制得1000ml标准菊芋汁；(2)制备复合培养基在制得的标准菊芋汁中添加配合量的玉米浆、大豆蛋白陈和半胱氨酸盐酸盐即得成品双歧杆菌发酵用复合培养基。
实施例3双歧杆菌发酵用复合培养基的组成为菊芋汁 1000ml玉米浆 5ml大豆蛋白陈 0.25g半胱氨酸盐酸盐 0.75g双歧杆菌发酵用复合培养基的制备(1)制备标准菊芋汁a.使用当年采集的菊芋，用水清洗干净；b.称取菊芋1000g放在水浴锅内，加水升温到100℃灭酶，时间10分钟；c.取出菊芋，将其粉碎成菊芋粉，加入75℃水600ml，用100目双层滤布过滤，取滤汁，滤渣加75℃水200ml，重复压榨、浸提三次，得到合并滤液970ml；d.取上述的合并滤液，加入清水30ml制得1000ml标准菊芋汁；(2)制备复合培养基在制得的标准菊芋汁中添加配合量的玉米浆、大豆蛋白陈和半胱氨酸盐酸盐即得成品双歧杆菌发酵用复合培养基。
权利要求
1.一种双歧杆菌发酵用复合培养基，其特征在于培养基的组成为菊芋汁 1000ml玉米浆 1-5ml大豆蛋白陈 0.25-0.75g半胱氨酸盐酸盐 0.25-0.75g
2.按权利要求1所述的双歧杆菌发酵用复合培养基，其特征在于培养基的组成为菊芋汁 1000ml玉米浆 3ml大豆蛋白陈 0.5g半胱氨酸盐酸盐 0.25g。
3.如权利要求1和2所述的双歧杆菌发酵用复合培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备标准菊芋汁a.使用当年采集或低温保存的菊芋，用水清洗干净；b.菊芋称重后放在水浴锅内，加水升温到100℃，灭酶，时间5-10分钟；c.将菊芋粉碎成菊芋粉，加适量70-85℃水，用100目双层滤布过滤，取滤汁，滤渣加70-85℃水适量，重复压榨、浸提，合并滤液；d.取上述的合并滤液，加水定容，控制量为100g菊芋制得100ml标准菊芋汁；(2)制备复合培养基在制得的标准菊芋汁中添加配合量的玉米浆、大豆蛋白陈和半胱氨酸盐酸盐即得成品双歧杆菌发酵用复合培养基。
全文摘要
本发明公开了一种双歧杆菌发酵用复合培养基。该培养基的配方为菊芋汁+玉米浆+大豆蛋白胨+半胱氨酸盐酸盐。双歧杆菌在其中生长良好，最高生长量可以达到10
文档编号C12N1/20GK1584013SQ200410012308
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月31日 优先权日2004年5月31日
发明者贾英民, 孙纪录 申请人:河北农业大学