一种两阶段发酵提高毕赤酵母产胆盐水解酶的方法与流程

本发明涉及一种两阶段发酵提高毕赤酵母产胆盐水解酶的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。

由于胆盐水解酶通常来源于乳酸菌等微生物中，其生长环境和发酵强度不适合大规模工业化生产。另一方面，目前报道的多数胆盐水解酶表达量低，易形成包涵体。因此，筛选一种能够酶活较高并能高效表达的胆盐水解酶基因对于工业化生产胆盐水解酶，及运用胆盐水解酶调节生物机体健康状况具有重要意义。

毕赤酵母宿主虽然具有表达蛋白易于纯化等优点，然而目前的胆盐水解酶在毕赤酵母中表达时，存在表达量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分适合于毕赤酵母宿主的问题，从而限制了胆盐水解酶在毕赤酵母中的高效表达，酵母真核表达系统中存在的糖基化现象对碱性果胶酶的高效表达及性质存在极大影响。

技术实现要素：

本发明提供一种两阶段发酵生产胆盐水解酶的方法，其特征在于，采用表达胆盐水解酶的重组毕赤酵母为出发菌株，两阶段控制策略发酵生产胆盐水解酶；所述两阶段控制策略是：菌体生长阶段控制温度为28～30℃，pH7.0～7.5，搅拌转速500～600rpm；产酶阶段将发酵温度降至25～28℃，pH 5.5～6.5，搅拌转速500～600rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述产胆盐水解酶的毕赤酵母是以pichia pastoris GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因的重组毕赤酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母还具有α-MF信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是以按体积比10-15％的接种量将毕赤酵母接种至发酵培养基中，25～28℃，200～220rpm下发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基配方包括：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵前还进行活化。

在本发明的一种实施方式中，所述活化是挑取毕赤酵母单菌落，接种至BMGY培养基中，30℃，200～220r/min培养16-24h。

在本发明的一种实施方式中，所述BMGY培养基含有蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，

本发明还提供所述的方法在制备含胆盐水解酶的产品中的应用。

有益效果：本发明提供了一两阶段发酵提高毕赤酵母产胆盐水解酶的方法，通过两阶段控制pH，使毕赤酵母发酵5d后，产胆盐水解酶的酶活提高至11.54U/mL，与分批发酵相比提高了62.1％。

附图说明

图1为两阶段发酵毕赤酵母产胆盐水解酶酶活。

具体实施方式

LB培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

YPD培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。

BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

胆盐水解酶酶活测定方法：将发酵液离心5min(10000×g，4℃)收集菌体，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在600nm下吸光度为1。取1mL上述细胞悬浊液，超声破碎1min(工作时间:间歇时间＝1:2)，离心10min(10,000×g,4℃)去除细胞碎片，得到无细胞提取物(cell free extract,CFE)。取0.1mL上清液加入1.8mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)和0.1mL胆盐(200mmol·L^-1)中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL15％三氯乙酸(w/t)终止反应，混合均匀，离心10min(离心机最大转速,4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液(包括0.5mL 1％茚三酮(溶解于0.5M柠檬酸缓冲液(pH 5.5)中)、1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的柠檬酸缓冲液(pH为5.5))混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。胆盐水解酶酶活定义为：单位时间内、单位体积的酶使结合型胆盐水解产生氨基酸的物质的量，单位μmol·(min·mL)^-1。

实施例1重组质粒的构建及鉴定

将植物乳杆菌来源的bsh基因(NCBI登录号为)进行密码自由化，并通过化学合成获得序列如SEQ ID NO.1所示序列，设计引物，通过融合PCR将SEQ ID NO.1所示序列与信号肽α-MF连接，柱回收产物获得融合片段。将融合片段αMF-bsh和pPIC9K质粒16℃过夜连接。连接产物pPIC9K-αMF-bsh化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。将转化液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。将重组质粒pPIC9K-αMF-bsh线性化，电击转化至pichia pastoris GS115感受态细胞，构建获得重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115-pPIC9K-αMF-bsh。

实施例2重组毕赤酵母的分批发酵

将实施例1构建的工程菌作为生产菌株，在YPD平板活化。挑取单菌落，接种至50mL/250mL BMGY培养基，30℃，220r/min培养24h，以此作为种子液，按体积比以10％的接种量转接至含1.5～2L BMMY培养基，并添加有10％甲醇的3L发酵培养基中，25～28℃，500～600rpm，pH 6.0～6.5，使溶氧浓度保持在10％以上，每24h流加终浓度5％的甲醇继续发酵5d，每12h取样检测酶活，发酵结果如图1所示，发酵5d酶活达7.12U/mL。

实施例3重组毕赤酵母的两阶段发酵

将实施例1构建的工程菌作为生产菌株，在YPD平板活化。挑取单菌落，接种至50mL/250mL BMGY培养基，30℃，220r/min培养24h，以此作为种子液，按体积比以10％的接种量转接至含1.5～2L BMMY培养基的3L发酵罐中开始发酵，调整通气量和搅拌转数，第一阶段(发酵前20～28h)控制温度为28～30℃，pH7.0～7.5，搅拌转速500～600rpm，补入终浓度10％的甲醇，；第二阶段(发酵28h至发酵结束)将发酵温度降至25～28℃，pH 6.0～6.5，搅拌转速500～600rpm，并每24h流加终浓度5％甲醇进行诱导，每12h取样检测酶活，结果如图1所示，两阶段控制pH发酵5d后，酶活提高至11.54U/mL，与分批发酵相比提高了62.1％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 吴银娣

<120> 一种两阶段发酵提高毕赤酵母产胆盐水解酶的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 972

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<213> 人工序列

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aaggttgaaa acttggacca ccactacgct atcatcggta tcactgctga cgttgaatct 180

tacccattgt actacgacgc tatgaacgaa aagggtttgt gtatcgctgg tttgaacttc 240

gctggttacg ctgactacaa gaagtacgac gctgacaagg ttaacatcac tccattcgaa 300

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