专利名称：一种新颖的耐酸耐胆盐、抗肠道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳杆菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学领域，更具体的，本发明涉及一种新颖的耐酸耐胆盐、抗肠道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳杆菌株。
背景技术：
乳酸菌是一类可发酵碳水合物、且主要生成乳酸的细菌的总称。目前，国际上已对乳酸菌进行大量的研究，并在实践上将乳酸菌应用于许多领域中。
通常，乳酸菌对含有大量外源凝集素的消化器官的上皮细胞具有亲和力。因而，从外环境获得的乳酸菌在体内倾向于结合到该区域上，并在其上增殖。并且，日常存在于体内的乳酸菌在这种附属表面上形成集落。
存在于上皮细胞上的乳杆菌属，与这些上皮细胞互相生存，这一特性给宿主带来健康功能性作用。不同种的乳酸菌可起到不同的作用，例如，(1)在细胞表面形成优势菌群，对病原微生物产生抑制作用；(2)菌株分泌抗细菌物质；(3)菌株有助于消化活性；(4)产生抗癌活性物质等。
近来的研究发现，用于人的益生菌最好来源于人体内。但是现在获得的许多的功能性乳酸菌菌株大多是从其它动物肠、粪便、食物、环境、土壤等获得。因此，虽然乳酸菌菌株对小肠和大肠具有黏附能力，但是当将它们作为食物摄取时，许多乳酸菌不能耐受胃酸和胆汁，因而不能通过胃、到达肠道。它们几乎都被胃酸杀灭。
因此，现有技术中迫切需要解决乳酸菌的应用和功效等问题。因此在人体内寻找出优势乳酸菌加以利用，对于维持人体健康、促进机体正常功能、延缓衰老等，将较其它来源的乳酸菌具有更强大的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于人体的新的鼠李糖乳杆菌菌株，该菌株可很好地粘附到胃和肠粘膜上，并可抵抗酸、胆汁，对病原性微生物(如幽门螺旋杆菌和大肠杆菌)具有抗性，同时具有抗氧化功能。
本发明的另一目的是提供含有所述鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途。
在本发明的第一方面，提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，所述鼠李糖乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1531。
在本发明的第二方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途，用于制备抑制幽门螺旋杆菌、大肠杆菌或其它肠道致病性菌的食物和/或药物。
在本发明的第三方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物的用途，用于制备预防和/或治疗细菌性消化道疾病的食物和/或药物。
在本发明的一个优选例中，所述的细菌性消化道疾病包括胃炎、胃溃疡、十二指肠炎、肠炎、结肠炎或直肠炎。
在本发明的第四方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途，用于制备抗氧化的食物和/或药物。
在本发明的第五方面，提供一种食物组合物，其中含有有效量的(如102-1012cfu/mL或102-1012cfu/g，优选的如105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更优选的如106-109cfu/g或106-109cfu/ml)所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物，以及余量的食品上可接受的载体。
在本发明的一个优选例中，所述的食物组合物选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。
在本发明的第六方面，提供一种药物组合物，其中含有有效量的(如102-1012cfu/mL或102-1012cfu/g，优选的如105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更优选的如106-109cfu/g或106-109cfu/ml)鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物，以及药学上可接受的载体。
在本发明的一个优选例中，所述的药物组合物剂型选自颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。
在本发明的另一优选例中，所述的药物或食物组合物的配方如下含有102-1012cfu/mL(或g)的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物；以及余量为食品上或药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1a和1b描述本发明的鼠李糖乳杆菌经革兰氏染色后的情况。
图2描述本发明的鼠李糖乳杆菌中使用API KIT 50 CHL进行的碳水化合物反应分析，50个小管(1-49号)中，0表示对照小管，黄色管表示其内碳水化合物因鼠李糖乳杆菌发酵而从紫变黄，七叶灵测定(25号管)则从紫变黑。
图3描述本发明乳杆菌中的16S rRNA的核苷酸序列测定结果。
图4描述本发明乳杆菌中的16S rRNA的核苷酸序列。
图5描述使用鼠李糖乳杆菌的特异性引物(L73R和LC4F)对所述乳杆菌进行PCR后的电泳结果。泳道1为DNA分子量markerλ-EcoT14 I消化物；泳道2为阴性对照；泳道3为本发明菌株，泳道4，5，6分别为鼠李糖乳杆菌6012、鼠李糖乳杆菌6013、鼠李糖乳杆菌grx05。
图6描述本发明鼠李糖乳杆菌引物Rha1和Rha2的PCR鉴定结果；泳道M为DL2000，泳道1为空白，泳道2为阴性对照，泳道3为本发明的鼠李糖乳杆菌的鉴定结果。
图7描述使用引物OPG4扩增鼠李糖乳杆菌RAPD-PCR结果，泳道M为DL2000，泳道1为鼠李糖乳杆6012，泳道2为鼠李糖乳杆菌grx01，泳道3为鼠李糖乳杆菌grx02；泳道4为鼠李糖乳杆菌grx03，泳道5为本发明菌株，泳道6为鼠李糖乳杆菌grx05，泳道7为鼠李糖乳杆菌grx07，泳道8为鼠李糖乳杆菌grx09。
图8描述可粘附到人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞的体外粘附性试验特性。
图9描述所述乳杆菌对幽门螺旋杆菌的抑制效果。
图10描述所述乳杆菌对大肠杆菌的抑制效果。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究和实验，最终找到了一种具有优异的抗细菌特性的鼠李糖乳杆菌菌株(保藏号为CGMCC No.1531)，本发明人将该菌株命名为“鼠李糖乳杆菌LV108”。多种试验表明，所述的鼠李糖乳杆菌LV108具有抗幽门螺旋杆菌和大肠杆菌等有害菌的能力以及抗氧化能力，具有耐受低pH值和胆汁酸盐的能力，并具有很强的消化道黏附能力。基于此完成了本发明。
如本文所用，术语“本发明的鼠李糖乳杆菌”，“鼠李糖乳杆菌菌株LV108”可互换使用，都指保藏号为CGMCC No.1531的鼠李糖乳杆菌菌株LV108。
本发明所述的鼠李糖乳杆菌菌株LV108是通过以下方法、经过长期的分析和筛选而获得(1)从广西巴马瑶族自治县和新疆和田地区长寿老人粪便中分离的乳酸菌；(2)对分离获得的1000多株乳酸菌、选用特异性培养基、结合生长特性等，初步确定乳酸菌类群；(3)分析共性优势乳酸菌，确定3种优势乳酸菌；(4)从初步确定的优势乳酸菌中，比较它们的加工和生长特性，筛选出具有优异的抗细菌特性、耐酸和胆汁酸盐能力、优良抗氧化能力的安全乳酸菌，从而可广泛用于乳品加工、功能食品生产、增进健康的添加剂、新药开发等。
本发明采用以下途径对所述乳杆菌菌株进行鉴定(1)利用生理、生化特征进行分析；(2)使用API KIT 50 CHL进行糖发酵分析；(3)通过进行16SrRNA序列分析，将本发明的乳杆菌菌株与标准的菌株进行比较，以便确切证实所述细菌菌株。(4)进行RAPD聚合酶链式反应(PCR)，以对所得结果与常规菌株进行比较。结果，鉴别出所述乳杆菌就是鼠李糖乳杆菌。
具体而言，使用API KIT 50 CHL糖发酵，分析使用特定程序，证实99％的精确度属于鼠李糖乳杆菌。通过使用16S rRNA测序和核苷酸序列BLAST分析，所述菌株以95％以上的精确度被证实属于鼠李糖乳杆菌。此外，当使用对鼠李糖乳杆菌特异性的引物进行PCR时，在本发明的菌株和经验证的鼠李糖乳杆菌中都发现了大约300bp的类似片段，这证明了本发明该菌株属于鼠李糖乳杆菌。
另一方面，当比较16SrDNA测序的结果时，本发明的菌株显示与鼠李糖乳杆菌MCRF-412和MCRF-271株存在一些不同。
当使用对鼠李糖乳杆菌特异的L73R和LC4F引物进行聚合酶链式反应时，在730bp和448bp的片段在试验株和其它已经验证的鼠李糖乳杆菌中是共有的，而其它条带则互不相同。然而，当使用对鼠李糖乳杆菌特异的Rha1和Rha2引物进行PCR时，在该菌株中发现约150bp和448bp的片段，而用OPG4引物进行PCR时，在850bp处与其它菌株具有明显差异。因此利用Rha1和Rha2，以及OPG4引物可以用于筛选鉴定出本发明菌株，从而可证明该菌株具有其自己的特异特征。
为了证实所述细菌菌株的安全性，选择使用ICR小鼠作为实验动物。在本发明第一个实施例中，将菌株接种到10％脱脂乳中培养24小时(约5×109cfu/mL)，取健康小鼠20只，雌雄各半，体重20±2g，饲养观察一日，活动正常，进食状况良好，实验前禁食12小时后称重，分别按0.4mL/10g灌服样品，2次/天，给药后即对动物的精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状况及死亡情况进行观察，连续喂养7天，2个月后检测其安全性，发现器官维持正常的外观，包括胃粘膜和小肠粘膜在内的消化器官与对照组的消化器官类似。
另一方面，本发明的鼠李糖乳杆菌还具有抵抗酸和胆盐能力。为了研究菌株的抗酸、胆汁能力，本发明人用混合酸将MRS培养基分别调节成pH2.0 MRS培养基、pH3.0 MRS培养基、pH4.0 MRS培养基，在pH2.0 MRS培养基、pH3.0MRS培养基中各加入2.0％、3.0％、4.0％、5.0％的胆汁酸盐。结果表明，本发明菌株可以在pH2、3.0％胆汁酸中放置5小时而仍有活菌检出，说明可具有较强抵抗酸和胆盐双重能力。
另一方面，本发明的鼠李糖乳杆菌菌株具有较强的粘附能力。为了检测菌株的粘附能力，本发明人进行了人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞的体外粘附性试验。分别测定了菌株的粘附能力及对致病性大肠杆菌粘附的竞争性黏附抑制作用，并与其它鼠李糖乳杆菌菌株作了比较。通过实验证实菌株具有肠道粘附能力。
另一方面，本发明的鼠李糖乳杆菌菌株具有抑制幽门螺旋杆菌作用。将冻融后的幽门螺旋杆菌吸取少量于Skirrow氏培养基表面，稍推开后，置于密封罐中37℃培养，密封罐内创造微氧环境，抽成真空，充填CO2气体和N2气体。用生理盐水将培养皿表面的菌落洗脱下来，同麦氏标准比浊管进行比浊，确定菌数，使其浓度控制在105cfu/mL。吸取菌液0.5mL于相应固体培养基平板上，用无菌涂抹棒，于超净工作台内通无菌空气，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径4mm，孔深3mm。将调整好浓度的乳酸菌菌液注至满孔，不可溢出孔外，于合适生长环境培养48h观察结果并测量抑菌圈直径；同时用与其它鼠李糖乳杆菌株做对照。证实了该菌株对幽门螺旋杆菌较强的抑制作用。
另一方面，本发明的鼠李糖乳杆菌菌株具有抑制大肠杆菌的作用。采用单层营养琼脂平板扩散法(AWDA法)进行定性试验，结果发现所分离的乳酸菌菌株对大肠杆菌有抑制作用。
另一方面，本发明的鼠李糖乳杆菌菌株具有抗氧化的能力。利用ICR小鼠，雌雄各半，体重20g±2.0g，灌胃菌株培养物(约1×109cfu/g)和阳性对照品VE，连续8天，末次灌胃后1h，摘眼球取血，分离血清测试SOD活力和MDA含量，结果该菌株培养物具有显著提高小鼠抗氧化能力，减少体内脂质过氧化物的生成。
本发明还提供了含有作为有效成分的本发明的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物或所述抗细菌物质的食物组合物。该菌株或含有菌株的食物组合物可起到预防和/或治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎等的作用。
此外，本发明还提供了可作为活性成分的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物或所述抗细菌物质的功能食品或药品。所述的食品或药品可起到预防和/或治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎等的作用。
更具体的，所述食品可以是含有所述鼠李糖乳杆菌的发酵牛奶或其它食物，比如由活的鼠李糖乳杆菌和/或由鼠李糖乳杆菌培养获得的产物制备成的各种粉末状产品，加入活的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物的各种冷冻产品，经鼠李糖乳杆菌发酵的各种发酵乳产品，添加活性鼠李糖乳杆菌制成的各种饮料，加了鼠李糖乳杆菌的提取物的各种饮料和冷冻产品等等。
此外，本发明还提供含有活的鼠李糖乳杆菌或失活的鼠李糖乳杆菌的各种培养物或代谢产物制成的液体、固体粉末等以及含有所述乳酸菌提取物和纯化的抗细菌物质的各种各样的食用的制剂形式。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”或“食品上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”或“食品上可接受的载体”是用于将本发明的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持鼠李糖乳杆菌或其代谢产物活性的载体。
本发明还包括药物和/或食物组合物，它包括给哺乳动物施用药物或食物上有效量的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物。本发明的组合物可用于预防和/或治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎，由大肠杆菌和其它肠道致病菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎等；以及可用于抗氧化。
当本发明的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物用于上述用途时，它们可与一种或多种食品上或药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服施用片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05％-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10％-50％糖)。例如，这些制剂可含有102-1012cfu/g或102-1012cfu/ml(特别的，可含有105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更特别地，可含有106-109cfu/g或106-109cfu/ml)的活性鼠李糖乳杆和/或发酵产生的活性成分。
在本发明中，“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。比如，在本发明中，可制备含有102-1012cfu/g或102-1012cfu/ml(特别的，可含有105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更特别地，可含有106-109cfu/g或106-109cfu/ml)的鼠李糖乳杆和/或其代谢产物的制剂。
当用于制备药物组合物时，所用的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约102-1012cfu/g或102-1012cfu/ml(特别的，可含有105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更特别地，可含有106-109cfu/g或106-109cfu/ml)的活性鼠李糖乳杆或发酵产生的活性成分。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
所述的鼠李糖乳杆菌或其代谢产物可通过口服等途径给予。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合鼠李糖乳杆菌或其代谢产物特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。
本发明的主要优点在于(a)本发明的鼠李糖乳杆菌具有优异的抗细菌特性、具有优异的耐酸和胆汁酸盐能力、以及具有优异的抗氧化能力。
(b)本发明的鼠李糖乳杆菌具有预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照《微生物实验手册》(James Cappuccino和Natalie Sherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1样品的来源和采集本发明菌株来源于中国的2个长寿村，也是世界第4和第5个长寿村——广西巴马瑶族自治县和新疆和田地区长寿老人粪便。
巴马县位于广西的西北部，属于山地丘陵地带。平均海拔在400-600米，负氧离子多，空气清新。当地人多分散居住在山区、河谷、林区，无噪音。巴马地处亚热带，植物生长茂盛，四季常青，有利于保护视力。植物种类多达2000种以上，降水量和水利资源丰富。饮水都是相当程度的硬水，含有大量多种微量元素。雨热同季，春凉秋爽，夏天无酷暑，冬暖无严寒。得天独厚的自然环境为巴马人长寿提供了良好的自然条件。
和田位于新疆最南端，古称于阗，藏话意思为“产玉石的地方”。是丝绸之路南道上的重镇。和田地区总面积为24.8万平方公里，人口150万。其中维吾尔族占总人口的97％以上。早在商周时期，古于阗就和中原有过物质交流。公元前68年，汉宣帝“遣卫司护鄯以西之诸国”，于阗正式纳入汉朝中央政府的统辖之下。古于阗是西域最早的佛教中心，有丰厚的佛文化遗产；许多著名高僧如晋时法显、唐时玄奘都曾涉足和田。而浓郁、独特的民俗风情，更使人耳目一新，饱领异域风采。和田气候温暖，特产丰富，民风淳朴，素以“金玉之邦、粮棉之仓、丝绸之路、瓜果之乡著称于世。并以玉石、地毯、丝绸等传统物产享誉海内外。这里有世界第二大沙漠的胜景，两千年历史的丝绸古迹，以及人与大自然搏斗创造的沙漠绿洲、千里葡萄长廊等人文景观。
本发明样品采集分3次，其中广西2次，新疆1次。广西采取两个典型长寿家族不同世代的粪便及当地长寿典型村落巴马瑶族自治县甲篆乡平安村巴盘屯长寿老人的粪便，对象包括巴马90岁以上的健康长寿老人23位，其中百岁以上的长寿老人6位。
新疆采取主要针对和田地区周边50公里范围内，分布在3个区的18位90岁以上的长寿老人。
实施例2从长寿老人粪便中分离出乳酸菌菌种筛选共进行了5年(2000-2005)，从广西巴马及新疆和田长寿老人(90岁以上)54个粪便样品浸入MRS肉汤培养物中，在37℃厌氧培养24小时。将该培养物涂布在MRS琼脂平板上，然后在37℃培养3天。培养后，收集在琼脂培养基上出现的菌落，并进一步纯化，利用菌落形态筛选共获得1000多株产酸菌，通过对其产物测定获得乳酸菌，根据生长特点、代谢特征，并选用特异性培养基，获得优势乳酸菌。从3种优势乳酸菌中，根据其特性，获得优良特性乳酸菌一株。所述的鼠李糖乳杆菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1531，保藏日为2005年11月10日。
用其检测细菌特征，包括生理生化反应，以及如下文所述的革兰氏染色、糖发酵能力等(特性鉴定方法如下文所述)。
分离菌株添加10％脱脂乳的肉汤培养物，培养、冻干、保存在-18℃，然后用于检测细菌各种特征试验。
实施例3乳酸菌菌株革兰氏染色采用革兰氏染色法检测菌株的特征。结果如图1所示，本发明的菌株呈革兰氏阳性菌，为无芽孢，棒状，大小为1.0-1.5μm，这是乳杆菌属的典型特征。
然后，研究该乳酸菌，以阐明其培养特征。结果是，该菌种在MRS琼脂平板上长成直径为2-3mm的灰色菌落，最佳培养温度在37℃。
实施例4使用API KIT 50 CHL对菌株进行分析在37℃，在厌氧条件下将该菌株在MRS琼脂平板上培养48小时，然后用悬浮培养基将所得培养物悬浮，悬浮液的浊度与McFarland 2的相同。然后，将该培养细胞接种到API 50 CHL试剂条(购自法国生物梅里埃公司)中，在其上层覆盖一层无菌石蜡，以便检测对49种碳水化合物的发酵能力。
使用API识别软件程序(法国生物梅里埃公司)分析了碳水化合物发酵能力。结果见图2和表1。表1中，0表示对照小管，GLY-5KG(共49种)表示各种供本发明的鼠李糖乳杆菌发酵的碳水化合物，分别对应于图2中各个小管(阳性结果如果发酵碳水化合物，由于培养物中所含溴甲酚紫指示剂产酸作用从紫变黄，七叶灵测定(25号管)则从紫变黑)，软件分析结果显示本发明的菌株的糖发酵能力与其它经验证的鼠李糖乳杆菌相似，相似度99％以上。表1中所用碳水化合物GLY-5KG各缩写的意义可参见法国生物梅里埃中国有限公司提供的操作手册——《API细菌鉴定金标准》，122-125页。
表1
实施例5总基因组DNA的抽提将本发明菌种接种到脱脂乳培养基活化，平板划线分离(MRS琼脂培养基)，挑取单菌落接种液体培养基，置于CO2恒温箱深层厌氧培养(温度37℃ 浓度10％)，48小时后收集试管底部的乳酸菌细胞，用于基因组DNA的抽提。取1.5mL细胞培养液于离心管，6000g离心5min弃上清；沉淀用3mL生理盐水(85％NaCl)洗涤菌体细胞3-5次；沉淀细胞加1200μL抽提缓冲液，并使之悬浮，250μL10％SDS和750μL氯化苄。振荡混匀，60℃振荡水浴保温40min，其间隔10min颠倒混匀数次，可适当延长时间至1h，效果更好；超声波处理10min；加入750μL3M的NaOAc(pH5.0)，冰浴20min；8000g离心10min收集上清，加0.8倍体积的异丙醇10000g离心10min沉淀；得到的DNA用70％的乙醇洗涤，溶于150μL的TE缓冲液，加入RNase在37℃消化1h进一步去除RNA。
将提取的乳酸菌基因组DNA样品，各取10uL用1％的琼脂糖进行凝胶电泳，EB染色后，在凝胶成像系统上观测，分析纯度和基因组DNA的完整性。然后将提取的乳酸菌基因组DNA样品在紫外分光光度计上测量OD260nm和OD280nm，对DNA浓度进行定量。
实施例616S rRNA测序分析由于对于细菌来说，16s rRNA是比较稳定的，因此16s rRNA的序列分析是细菌鉴定的很好方法。
将提取的实验菌株的基因组DNA作为模板用于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增16S-rDNA序列。
用于本发明乳酸菌的16S-rDNA测序分析的引物为上游引物(SEQID NO2)5’-AGAGT TTGAT YMTGG CTCAG-3’(其中，Y、M代表兼并引物，Y代表(CT)，M代表(AC))下游引物(SEQ ID NO3)5’-ACGGT TACCT TGTTA CGACTT-3’PCR反应体系组成为PCR反应的总体积50μL，其中含10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTPs 4.0μL，5U/μL Tag酶2.0μL， 50pmol/μL上游引物4.0μL，50pmol/μL下游引物4.0μL，20ng/μL模板DNA 5.0μL，ddH2026μL。
反应程序为95℃预变性5min，95℃变性1min 55℃退火50s，72℃延伸2min30次循环；95℃变性1min 55℃退火50s，72℃延伸2min 1次循环；72℃后延伸10min 1次循环。
扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离，用0.5μg/mL的溴化乙锭染色，在凝胶成像系统上观察分析后用凝胶抽提试剂盒(购自上海博彩生物工程公司)回收1500bp大小的DNA片段，并克隆到pEGM-T载体(购自申能博彩公司)中，按分子克隆手册上提供的方法转化大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的IPTG/X-galLB平板上进行筛选，挑取阳性克隆经鉴定后，测定16S-rDNA序列。测序结果见图3，16S-rDNA序列见图4(即SEQ ID NO1)。
实施例7使用BLAST分析核苷酸序列数据将上述测定的16S-rRNA序列使用BLAST程序(美国生物信息中心网站，NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)同已知的多种鼠李糖乳杆菌进行同源性比较，根据获得的距离值，建立系统树。
结果发现，本发明的鼠李糖乳杆菌的16S-rRNA序列与目前已知的其它所有鼠李糖乳杆菌的相应序列皆不同，与鼠李糖乳杆菌的同源性最高(达95％以上)。
实施例8特异性引物鉴定鼠李糖乳杆菌本发明人根据鼠李糖乳杆菌16S rRNA和23S rRNA设计了一种属特异性引物，如表2。
表2引物
本发明人采用20μl PCR反应体系(PCR条件同上)，结果发现L73R和LC4F引物进行聚合酶链式反应时，在730bp和448bp的片段在试验株(泳道3)和其它鼠李糖乳杆菌(泳道4，5，6分别为鼠李糖乳杆菌6012、鼠李糖乳杆菌6013、鼠李糖乳杆菌grx05，均购自扬州大学)中是共有的，而其它条带则互不相同。结果见图5。
实施例9多重RAPD PCR分析对本发明中的鼠李糖乳杆菌菌株以及已知的鼠李糖乳杆菌菌株的基因组DNA进行随机多态性扩增(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)分析，以比较该菌株与其它鼠李糖乳杆菌菌株在基因组DNA的差异。本实施例中其它鼠李糖乳杆菌菌株包括泳道1为鼠李糖乳杆菌6012，泳道2为鼠李糖乳杆菌grx01，泳道3为鼠李糖乳杆菌grx02；泳道4为鼠李糖乳杆菌grx03，泳道5为本发明菌株，泳道6为鼠李糖乳杆菌grx05，泳道7为鼠李糖乳杆菌grx07，泳道8为鼠李糖乳杆菌grx09。(鼠李糖乳杆菌6012，鼠李糖乳杆菌grx02；鼠李糖乳杆菌grx03，鼠李糖乳杆菌grx05，鼠李糖乳杆菌grx07，鼠李糖乳杆菌grx09均购自扬州大学)。
根据前面所述方法进行乳酸菌基因组DNA的提取，完整性和浓度分析后取100ng基因组DNA样品按如下方法进行RAPD分析。合成的随机引物的序列如表1所示。采用经过优化的RAPD扩增反应体系反应的总体积25μL，其中含10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，5U/μL Tag 酶1.0μL，50pmol/μL随机引物2.0μL， 20ng/μL模板DNA 5.0μL，ddH20 12.5μL。反应程序为93℃2min，36℃1min，72℃2min 1次循环；93℃1min，36℃1min，72℃2min，40次循环；93℃1min，36℃1min，72℃10min 1次循环(在进行随机引物的筛选中，针对不同的引物，需要对退火温度进行适当的调整)。扩增完毕，在1.4％琼脂糖凝胶上，加含EB0.5μg/mL电泳分离，在凝胶成像系统上拍片分析。本实验从30条随机引物(序列见表3所示)中筛选到1条在种和菌株水平具有良好鉴别力的的引物OPG4。
结果如图7所示，表明在850bp处与其他菌株具有明显差异，OPG4引物可以用于筛选鉴定出本发明的菌株。
表3RAPD分析中所使用的随机引物
注*表示经筛选具有菌株水平特异性的随机引物在前面的试验中，本发明人通过采用多重RAPD-PCR技术来筛选随机引物从而产生菌株特异性的标记。通过对30条随机引物不同的组合，产物片断介于0.6-2.2kb。在引物5′-ACGAGGCAC-3′和5′-ACGCGCCCT-3′组合的PCR产物分析中发现，在613bp处存在一菌株特异性标记，可以用以鉴定鼠李糖乳杆菌。将此产物回收克隆测序，并在克隆片断的序列末端设计引物(表4)表4引物
结果见图6，在该菌株中发现约150bp和448bp的片段，与其他鼠李糖乳杆菌不同，证实该菌株有其特有的特性。
实施例10对本发明菌株和鼠李糖乳杆菌DNA进行核苷酸序列比较测定本发明菌株和鼠李糖乳杆菌MCRF-412、鼠李糖乳杆菌MCRF-271的16s-rDNA核苷酸序列比较，本发明菌株在第545位的核苷酸为G，而鼠李糖乳杆菌MCRF-412、鼠李糖乳杆菌MCRF-271中为C。
实施例11本发明菌株LV108对ICR小鼠的安全性为了检测LV108的安全性，选择使用ICR小鼠。具体是，将LV108菌株接种到11％脱脂乳中培养24h(约5×109cfu/mL)，取健康小鼠20只，雌雄各半，体重20±2g，饲养观察一日，活动正常，进食状况良好，实验前禁食12小时后称重，分别按0.4mL/10g灌服样品，2次/天，给药后即对动物的精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状况及死亡情况进行观察，连续喂养7天，2个月后检测其安全性，结果如表5所示。
表5本发明的乳酸菌的安全性
由表5可见，小鼠对该菌发酵液的最大耐受量为80mL/kg。给药后小鼠未出现不适症状，小鼠活动有所减少，余基本正常，在整个观察期间精神状态良好、毛色光洁、活动自如、呼吸均匀、口鼻内无异常分泌物，动物饮食量正常，便软，小便无异常。观察一周后，称体重，周体重增长率为25.1％。于2个月后脱颈椎处死动物，并对所有动物进行尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等内脏器官均未见任何异常。
将给药小鼠的胃、小肠和大肠中的粘液涂布到MRS琼脂平板上，于37℃培养48小时，从给药组中分离出大量的乳酸菌LV108株，但是在对照组中未检测到。
实施例12本发明菌株LV108的抗酸及抗胆盐能力研究了鼠李糖乳杆菌LV108的抗酸和抗胆盐能力，在MRS培养基上，用混合酸将MRS培养基分别调节成pH2.0 MRS培养基、pH3.0 MRS培养基、pH4.0 MRS培养基，在pH2.0 MRS培养基、pH3.0 MRS培养基中各加入2.0％、3.0％、4.0％、5.0％的胆汁酸盐。
在不同的培养基中，按2％的接种量接种试验菌的培养液，置37℃分别培养1h、2h、3h、4h、5h、6h、16h，以Oh为对照，检测活性乳酸菌数。
结果表明，本发明菌株可以在pH2、3.0％胆汁酸中放置5小时，仍有活性乳酸菌数检出。在pH3、3.0％中存活率高于pH2、3.0％中的存活率。证明本发明菌株具有较强的抗酸及抗胆盐能力。
实施例13鼠李糖乳杆菌LV108对人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞的体外粘附性试验为了检测本发明菌株的粘附能力，本发明人进行了人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞(购自中科院上海生化所)的体外粘附性试验(见图8)，本试验菌株在人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞表面紧密粘附了大量本发明菌株，通过实验发现本发明菌株平均达到18.7±5.92个/细胞，较其它乳酸菌多，平均较一般鼠李糖乳杆菌高出约6.0个/细胞。
同时测定了本发明菌株对致病性大肠杆菌粘附的竞争性抑制作用，并与鼠李糖乳杆菌6012、鼠李糖乳杆菌6013作了比较，本发明菌株竞争性粘附抑制作用强。
实施例14鼠李糖乳杆菌LV108的抗氧化能力本发明人研究了鼠李糖乳杆菌LV108对实验小鼠(ICR小鼠，雌雄各半，体重20±2g，购自南京江宁汤山青龙实验动物中心)抗氧化能力的影响。采用正常小鼠分别灌胃给予鼠李糖乳杆菌发酵乳(约1×109cfu/g)，设立(设高、低两个剂量组)，另设对照组和阳性对照品(维生素E9mg/kg)，每组10只小鼠，按40mL·kg-1·d-1等容量不等浓度灌胃给予受试品和阳性对照品维生素E，连续8天，对照组同时灌胃生理盐水。末次灌胃后1小时摘眼球取血，分离血清测试SOD活力和MDA含量。按黄嘌呤氧化酶法(SOD试剂盒购自南京聚力生物制品公司)测定血清中的SOD含量；按硫代巴比妥酸法(MDA试剂盒购自南京聚力生物制品公司)测定血清中的MDA。
结果见表6。鼠李糖乳杆菌发酵乳与对阳性照品维生素E使SOD活力增高，MDA含量降低，与对照组比较差异非常显著。说明鼠李糖乳杆菌LV108可不同程度增强小鼠的抗氧化能力，减少体内脂质过氧化产物的生成。
表6鼠李糖乳杆菌发酵乳抗氧化功能试验测定结果
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01实施例15鼠李糖乳杆菌LV108对大肠杆菌的抑制作用将大肠杆菌0157H7(购自扬州大学)接种于营养肉汤中，37℃培养18h后，平板计数法计活菌数。控制其活菌数约106cfu/mL，此浓度易致病。吸取菌液0.5mL于相应固体培养基平板上，用无菌涂抹棒，于超净工作台内通无菌空气，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径4mm。孔深3mm，将调整好浓度的乳酸菌菌液注至满孔，不可溢出孔外，于各自生长环境培养48h观察结果、测量抑菌圈直径；同时用鼠李糖乳杆菌6012(购自扬州大学)做对照。
本发明菌株对大肠杆菌0157H7的抑菌圈直径为12.6mm(图10)，而鼠李糖乳杆菌6012抑菌圈为12.0mm，显示鼠李糖乳杆菌LV108有较强的抑制作用。
实施例16鼠李糖乳杆菌LV108对幽门螺旋杆菌的抑制作用将冻融后的幽门螺旋杆菌(购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)。吸取少量于Skirrow氏培养基表面，稍推开后，置于密封罐中37℃培养，密封罐内创造微氧环境(85％N2，10％CO2，5％O2)，抽成真空，充填CO2气体和N2气体。用生理盐水将培养皿表面的菌落洗脱下来，同麦氏标准比浊管进行比浊，确定菌数，使其浓度控制在105cfu/mL。吸取菌液0.5mL于相应固体培养基平板上，用无菌涂抹棒，于超净工作台内通无菌空气，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径4mm。孔深3mm，将调整好浓度的乳酸菌菌液注至满孔，不可溢出孔外，于适宜生长环境培养48h观察结果并测量抑菌圈直径；同时用鼠李糖乳杆菌6012(购自扬州大学)做对照。
本发明菌株对幽门螺旋杆菌抑菌圈直径为12.7mm(图9)，而鼠李糖乳杆菌6012仅为9.5mm，显示鼠李糖乳杆菌LV108对幽门螺旋杆菌较强的抑制作用。
实施例17含鼠李糖乳杆菌的食物组合物原料配比如表7。
表7
按上述配方比例，将鲜奶加热到50℃以上，加入白砂糖搅拌至完全，预热到60-65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-10分钟，冷却至40-43℃，接种。接种数量为每1g上述混合物接种嗜热链球菌6035(购自扬州大学)1-100×106cfu、保加利亚乳杆菌6032(购自扬州大学)1-100×106cfu、鼠李糖乳杆菌LV108 1-50×106cfu。
40-42℃发酵至pH值为4.2-4.5，搅拌，充填，冷藏，即制成含活性鼠李糖乳杆菌的酸奶。
实施例18含鼠李糖乳杆菌的药物组合物原料配比如表8。
表8
按照比例将脱脂奶粉、乳糖、酵母粉、蛋白胨以纯净水混合均匀，预热到60-65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌20-30分钟，冷却至36-38℃，接入鼠李糖乳杆菌活菌(1-50×106cfu/mL)，36-38℃发酵至pH值为4.2-4.5，离心，冷冻干燥至水份含量小于3％，即制备成鼠李糖乳杆菌冷冻干燥物。称取0.5克鼠李糖乳杆菌冷冻干燥物与麦芽糊精等量混合后装入胶囊中，即制成含鼠李糖乳杆菌的药物组合物。
菌种保藏本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LV108已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1531，保藏日为2005年11月10日。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>统一企业(中国)投资有限公司统一企业(中国)投资有限公司昆山研究开发中心<120>一种新颖的耐酸耐胆盐、抗肠道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳杆菌株<130>059281<160>37<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1666<212>DNA<213>Lactobacillus rhamnosus<400>1tgcatgcctg caggtcgact ctagactcga gggatccaga tctccagtct tacggttacc 60ttgttacgac ttcaccctaa tcatttgtcc caccttagac ggctcgctcc ctaaaagggt 120tacgccaccg gcttcgggtg ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 180ccgggaacgt attcaccgcg gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt 240aggcgagttg cagcctacag tccgaactga gaatggcttt aagagattag cttgacctcg 300cggtctcgca actcgttgta ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg 360catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttactagag 420tgcccaacta aatgctggca actagtcata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 480acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg 540gaaagctgat ctctcaggtg atcaaaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc 600ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc 660aaccttgcgg tcgtactccc caggcggaat gcttaatgcg ttagctgcgg cactgaaggg 720cggaaaccct ccaacaccta gcattcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat 780cctgttcgct acccatgctt tcgagcctca gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc 840gccactggtg ttcttccata tatctacgca tttcaccgct acacatggag ttccactgtc 900ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg atgcacttcc tcggttaagc cgagggcttt 960cacatcagac ttaaaaaacc gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc ggataacgct1020tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttggat1080accgtcacgc cgacaacagt tactctgccg accattcttc tccaacaaca gagttttacg1140acccgaaagc cttcttcact cacgcggcgt tgctccatca gacttgcgtc cattgtggaa1200gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccga1260tcaacctctc agttcggcta cgtatcattg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc1320taatacgccg cgggtccatc caaaagcgat agcttacgcc atctttcagc caagaaccat1380gcggttcttg gatttatgcg gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc ccacttaagg1440gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc gccactcgtt caaaattaaa tcaagatgca1500agcacctttc aataatcaga actcgttcga cttgcatgta ttaggcacgc cgccagcgtt1560catcctgagc cagaatcaaa ctctagacct ggtctgcagg cggccgccca tgggatatca1620tcgatcatat gtcgccctat agtgagtcgt attacggtac cgagct 1666<210>2<211>20<212>DNA
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权利要求
1.一种鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1531。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备抑制幽门螺旋杆菌、大肠杆菌或其它肠道致病性菌的食物和/或药物。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗细菌性消化道疾病的食物和/或药物。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的细菌性消化道疾病包括胃炎、胃溃疡、十二指肠炎、肠炎、结肠炎或直肠炎。
5.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备抗氧化的食物和/或药物。
6.一种食物组合物，其特征在于，其中含有有效量的权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物，以及余量的食品上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的食物组合物，其特征在于，所述的食物组合物选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。
8.一种药物组合物，其特征在于，其中含有有效量的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物，以及药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物剂型选自颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。
10.如权利要求6或8所述的食物组合物或药物组合物，其特征在于，所述的组合物的配方如下102-1012cfu/mL或102-1012cfu/g的鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物；以及余量为食品上或药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种新的鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1531。本发明还提供了所述鼠李糖乳杆菌和/或其代谢产物的用途。本发明的菌株从长寿老人的排泄物中筛选获得，具有优异的抗菌特性，并具有耐酸和胆汁酸盐能力以及优良的抗氧化能力，食用安全，从而可广泛用于乳品加工、功能食品生产等领域。
文档编号A61K35/74GK1982437SQ200510111588
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者陈顺利, 顾瑞霞, 李正华, 席文博, 沈琴 申请人:统一企业(中国)投资有限公司, 统一企业(中国)投资有限公司昆山研究开发中心