一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺的制作方法
【专利说明】一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种为脆弱拟杆菌为主微生态的液固结合发酵工艺。
【背景技术】
[0003]脆弱类杆菌(b.fragilis)能分解糖，对胆汁耐受，为类杆菌属的代表株。革兰氏阴性杆菌，两端钝圆而浓染，中间有不着色部份。专性厌氧、无芽胞、无动力、直径为0.5X1.3?1.6um。脆弱类杆菌为专性厌氧菌，氯化血红素和20%胆汁可促进其生长，生化反应弱，解糖。解酶反应阳性，葡萄糖的终末代谢产物有乙酸和琥珀酸；吲哚不定，耐胆盐，水解七叶灵。不还原硝酸盐。产生苹果酸盐脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶(g6pdh)、6磷酸葡萄糖脱氢酶(6pgdh)、细胞壁粘肽层含有二氨基庚二酸。依据对鼠李糖、海澡糖，甘露醇发酵及吲哚试验可区别本组菌落。dna的g c含量为39?48%。本菌主要分布于结肠和口腔中。脆弱类杆菌致病因素有内毒素，由脂多糖和类脂a构成。脂多糖决定其抗原性，类脂a决定其毒性。由于它的内毒素的化学结构与典型内毒素不同，所以毒性比一般内毒素为低，但发现它的内毒素在体外能抑制中性白细胞的趋化性和吞噬作用。脆弱类杆菌还能产生β_内酰胺酶，破坏青霉素，故对青霉素有耐药性。本菌还产生肝素酶，这种酶有利于形成血栓性静脉炎和迁徙性脓肿。脆弱类杆菌还分泌透明质酸酶，dna酶，神经氨酸酶等，均与其侵袭力有关。脆弱拟杆菌e抗原与其致病性有关，如化脓，白血球先降低后升高，肝、肺，肾组织病变等。在临床上的无芽胞厌氧菌感染中占有重要的地位。
[0004]现有的培养技术主要是利用牛心脑浸液血琼脂、硫乙醇酸钠培养基、胰酶大豆琼脂和卡那霉素一万古霉素血琼脂。标本接种后置于37°C厌氧环境培养(如厌氧手套箱或厌氧罐)2 — 3d，挑选生长的菌落接种两个血平板，分别置于有氧和无氧环境中培养48h。但是现在一般都是菌株接种于液体培养基中，然后在无氧恒温状态下经12-72小时发酵，然后再进行过滤、洗涤、稀释、测菌，这样得出的菌株较少，而且操作复杂，浪费人力物力。
【发明内容】
[0005]根据以上技术问题，本发明提出一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺，其特征在于一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺为:
(1)制取液体培养液
首先制取液体培养液，其重量百分比为蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHP040.1-0.3%、硫乙醇酸钠 0.02-0.1%、牛肝浸液 30-60%、牛肉浸液30-60%、酵母膏0.1-0.8% ；
(2)—级菌种培养
以上述培养液作为培养基，装入细口试验瓶，121°C灭菌40分钟，然后接种5%原种培养物，在培养基上覆盖0.5mm的无菌食用植物油，然后以磨口瓶盖分封口，最后将培养器皿置于38 °C真空培养箱培养48小时；
(3)二级菌种培养
培养基及操作同以及菌种培养，但培养皿换为无色透明试剂瓶，接种一级菌种10%后，每隔5小时晃动1分钟，培养48小时，当细胞达到1.0亿CFU\g时终止培养，室温下保存备用；
(4)固体培养
制备固体培养基，豆柏粉1000g，浸润后进行蒸煮灭菌，将步骤3中的二级菌种培养液和固体培养基按照重量比0.1:1混合在一起，然后将培养物放入真空无菌室进行培养，恒温38 °C，发酵48个小时，至细胞数达4-6亿。
[0006]本发明的有益效果为:本发明采用液固相结合的发酵工艺，经本工艺可以在短时间内得到大量的脆弱拟杆菌，本发明工艺简单、投资少，操作时易于控制，在操作时都是在真空无菌条件下进行，不易感染杂菌，菌株浓度高。与单纯液体发酵的脆弱拟杆菌相比液固发酵出的脆弱拟杆菌营养成分齐全并具有较强的生物活性，对防治急慢性肠炎、菌群失调、上呼吸道感染和神经功能正等均有很好的疗效，用作饲料添加剂可以正价畜、动物体重、产蛋量及增强抗病力，还可以用于制备化妆品、保健食品和饮料等。
[0007]
【具体实施方式】
根据【具体实施方式】对本发明进行进一步说明:
实施例1
(1)首先制取液体培养液，其重量百分比为蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸 0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHP040.1-0.3%、硫乙醇酸钠 0.02-0.1%、牛肝浸液30-60%、牛肉浸液 30-60%、酵母膏 0.1-0.8% ；
(2)—级菌种培养
以上述培养液作为培养基，装入细口试验瓶，121°C灭菌40分钟，然后接种5%原种培养物，在培养基上覆盖0.5mm的无菌食用植物油，然后以磨口瓶盖分封口，最后将培养器皿置于38 °C真空培养箱培养48小时；
(3)二级菌种培养
培养基及操作同以及菌种培养，但培养皿换为无色透明试剂瓶，接种一级菌种10%后，每隔5小时晃动1分钟，培养48小时，当细胞达到1.0亿CFU\g时终止培养，室温下保存备用；
(4)固体培养
制备固体培养基，豆柏粉1000g，浸润后进行蒸煮灭菌，将步骤3中的二级菌种培养液和固体培养基按照重量比0.1:1混合在一起，然后将培养物放入真空无菌室进行培养，恒温38 °C，发酵48个小时，至细胞数达4-6亿。
[0008]实施例2
将养鸡场同种同日龄的产蛋鸡100只，在相同的生活条件下，用同种饲料喂养，随机抽样，分成AB两组各50只，A组每日每只鸡服用添加有液固工艺发酵出的菌的饲料，B组每日每只鸡服用添加有液态培养工艺发酵出的菌，添加的菌数相同，试验期为2个月，其中喂食带有添加剂的饲料一个月，喂食不带有添加剂的饲料一个月，在两个月中A组产蛋产量相对于B组增加17.53Kg。
[0009]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺为: 首先制取液体培养液，其重量百分比为蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHP040.1-0.3%、硫乙醇酸钠 0.02-0.1%、牛肝浸液 30-60%、牛肉浸液30-60%、酵母膏0.1-0.8% ； 一级菌种培养 以上述培养液作为培养基，装入细口试验瓶，121°C灭菌40分钟，然后接种5%原种培养物，在培养基上覆盖0.5mm的无菌食用植物油，然后以磨口瓶盖分封口，最后将培养器皿置于38 °C真空培养箱培养48小时； 二级菌种培养 培养基及操作同以及菌种培养，但培养器皿换为无色透明试剂瓶，接种一级菌种10%后，每隔5小时晃动1分钟，培养48小时，当细胞达到1.0亿CFU\g时终止培养，室温下保存备用； (4)固体培养 制备固体培养基，豆柏粉1000g，浸润后进行蒸煮灭菌，将步骤3中的二级菌种培养液和固体培养基按照重量比0.1:1混合在一起，然后将培养物放入真空无菌室进行培养，恒温38 °C，发酵48个小时，至细胞数达4-6亿。
【专利摘要】本发明提出一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺，首先制取液体培养液，其重量百分比为蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHPO40.1-0.3%、硫乙醇酸钠0.02-0.1%、牛肝浸液30-60%、牛肉浸液30-60%、酵母膏0.1-0.8%；本发明采用液固相结合的发酵工艺，经本工艺可以在短时间内得到大量的脆弱拟杆菌，本发明工艺简单、投资少，操作时易于控制，在操作时都是在真空无菌条件下进行，不易感染杂菌，菌株浓度高。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/01
【公开号】CN105274019
【申请号】CN201410319989
【发明人】王军, 程亚龙, 翟建武
【申请人】王军
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月8日