脆弱拟杆菌在抗水产病原菌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别是脆弱拟杆菌在水产养殖中的应用，具体为脆 弱拟杆菌在抗水产病原菌中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国水产养殖业的不断发展。工厂化、高密度养殖造成的病害问题日益突出。 每年因水产病害造成的损失多达数百亿元。而治疗水产动物的疾病，常规仍广泛采用化学 治疗法，抗生素的滥用使水体细菌产生抗药性及药物残留，间接危害了人类的健康。因此， 越来越多的专家开始关注利用自然环境中有益微生物对水产养殖环境的生物修复，以此来 取代抗生素的使用，这样不仅节约了费用，还不会产生二次污染，而且还能将剩余饵料、排 泄物及其他有害物质分解转化，使水质保持良好的状态，使养殖生物处于健康水平。
[0003] 因此，有益微生物对水产养殖环境的生物修复技术的研究和开发具有极其广阔的 前景，在水产养殖领域的应用也会越来越广泛，同时带来更大的经济效益和社会效益。随着 规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，水产养殖病害频繁发生，为了控制疾病，一些抗生 素药物在水产养殖中被广泛使用和滥用，不仅造成环境中药物残留、细菌耐药性增加，而且 由于水体环境的流动性，耐药基因更容易水平转移，造成更多耐药株的出现。为了应对耐药 性，养殖中不得不加大用量并不断更换药物种类，进而造成恶性循环。另一方面药物的大量 使用，药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题也日益引起关注。为了应对这些问题， 采用替代的生物防治措施成为当前水产养殖的热点，其中益生菌的应用在水产养殖中越来 越受到重视，它们不仅具有抑制细菌性病原的作用，还具有促进水产养殖动物生长、改善免 疫等作用。
[0004] 益生菌（Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体或动物肠 道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益 微生物的总称。其主要通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用。它具有改善肠道 菌群结构，抑制病原菌，生成营养物质，提高机体免疫力，消除致癌因子，降低胆固醇和血 压，改善乳糖消化性等功能。FulIer于1989年首次给益生菌下定义："益生菌是通过改善肠 道菌群平衡而对宿主健康产生有益作用的活菌添加剂"。
[0005] 人类生活中早已广泛应用的益生菌包括醋酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆 菌、放线菌、酵母菌等。随着微生物防害方法的发展，特别是益生菌在取代传统抗生素的使 用的前景，使得益生菌及其制剂越来越多地被应用于水产养殖业。目前水产养殖类的益生 菌及其制剂主要分为两类：
[0006] 1、单一制剂，如酵母菌、光合细菌、乳酸菌、乳酸杆菌、乳酸乳球菌、荧光假单胞菌、 芽抱杆菌等；
[0007] 2、复合制剂，如美菌方、复合型活性生物净水剂等，主要有硝化细菌和反硝化细 菌、枯草杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、假单胞菌、粪链球菌、酵母菌等菌株组成。该类益生菌群 由定向筛选的有益菌株配合而成，能够改善水产动物体内的微生态平衡，刺激机体的免疫 系统，拮抗致病微生物，降解有机废物，从而减少疾病发生，促进水产动物生长发育，改善养 殖生态环境。
[0008] 大量研究与实践证明，益生菌在水产养殖的应用中起到了良好的效果，如从虾等 动物体内分离得到的多株益生菌，从而制成的微生物复合菌液可以改良底质，稳定水质，是 保证养殖成功的重要技术。由于没有再施用化学药剂，因而生产出来的水产品是比较完全 和无污染的绿色食品，并可避免水产品产生抗药性。多年连续使用菌液的水体必定能形成 有效微生物菌群的生态优势，达到水环境的良性循环，保证对水产品养殖的持续发展。
[0009] 脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依培养基的不同和生长阶段的不同，菌体形态 呈现多形性，一般条件下菌体为杆状、两端钝圆、着色深，中间色浅且不均匀，有荚膜、无芽 胞、无动力，有些有空泡，菌体长短不一。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分， 主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。脆弱拟杆菌作 为一种条件致病菌，当宿主粘膜受损时，可侵犯粘膜下层，引起感染，也可经血液流动，引起 身体其它器官，如肠道、腹腔、肝、肺、脑组织、软组织、骨髓等的化脓性感染并伴发脓肿。
[0010] 本领域已经对脆弱拟杆菌进行了大量研究。张季阶从发育良好的婴儿或低龄动 物肠道中分离出一种拟杆菌菌株BF839,将其制成活菌制剂后能够增加儿童生长发育，对防 治急慢性肠炎、菌群失调、上呼吸道感染和神经官能症等较好疗效（参见公开号为 CN1056314A的中国发明专利申请；及:张季阶，等.脆弱拟杆菌(BF839)菌液的临床应用研 究.中国生物制品学杂志，1995年，第8卷，第2期，第63-65页）。智发朝等在2012年从婴儿粪 便中分离出一种具有益生菌特性的脆弱拟杆菌菌株(保藏号为CGMCC NO.7280)，可用于治 疗炎症性肠病、腹泻等（参见公开号为CN103146620A，CN103142658A及CN103156888A的中国 发明专利申请）；此外，经对该菌株的进一步鉴定，发现该菌株(称为Bd312)在细菌形态、培 养特性、生理生化反应结果与脆弱拟杆菌相似，经BLASTN序列比对，所分离菌株与脆弱拟杆 菌标准株ATCC25285同源性达99%，药敏实验提示，菌株Bd312对头孢拉定、阿莫西林、庆大 霉素、磺胺甲嗯唑、甲氧苄啶不敏感，急慢性毒性试验提示无毒性(参见:刘洋洋，等.健康婴 儿体内的无毒脆弱拟杆菌的分离及鉴定.中华医学杂志，2014年，第94卷，第30期，第2372-2374页）。但是目前尚无脆弱拟杆菌应用于水产病原菌防治的报道。
[0011] 市场上水产用益生菌产品，名目繁多，层出无穷，但是概括起来存在以下问题：
[0012] (1)水产益生菌产品以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌为常见，少见 其它类型细菌，有待增加不同种属益生菌；
[0013] (2)常见水产益生菌产品中菌株抑菌效果不明确，而抑菌效果是评价益生菌的核 心指标。
【发明内容】
[0014] 本发明所要解决的技术问题是提供一种脆弱拟杆菌在抗水产病原菌中的应用，包 括脆弱拟杆菌在制备用于水产病原菌的抗菌药物中的应用及含有该脆弱拟杆菌的药物组 合物及饲料添加剂。
[0015] 为了实现上述目的，本发明提供了一种脆弱拟杆菌在制备用于水产病原菌的抗菌 药物中的应用。
[0016] 上述的应用，其中，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌体、灭活脆弱拟杆菌、脆 弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。
[0017] 上述的应用，其中，所述水产病原菌为副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或 铜绿假单胞菌。
[0018] 上述的应用，其中，所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC No. 10685的脆弱拟杆菌ZY-312、保藏号为CGMCC从).7280的脆弱拟杆菌8(1312或脆弱拟杆菌标准株4了〇：25285。
[0019] 为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于抗水产病原菌的药物组合 物，其中，所述药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌。
[0020] 上述的药物组合物，其中，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌体、灭活脆弱拟杆 菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。
[0021] 上述的药物组合物，其中，所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC No. 10685的脆弱拟 杆菌ZY-312、保藏号为CGMCC从).7280的脆弱拟杆菌8(1312或脆弱拟杆菌标准株4了〇：25285。
[0022] 为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于抗水产病原菌的饲料添加 剂，其中，所述饲料添加剂含有脆弱拟杆菌。
[0023]上述的饲料添加剂，其中，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌体、灭活脆弱拟杆 菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。
[0024]上述的饲料添加剂，其中，所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC No. 10685的脆弱拟 杆菌ZY-312、保藏号为CGMCC从).7280的脆弱拟杆菌8(1312或脆弱拟杆菌标准株4了〇：25285。 [0025]本发明的技术效果在于：
[0026]本发明通过在多种疾病模型中对脆弱拟杆菌的作用进行检测和鉴定，证明脆弱拟 杆菌对水产病原菌具有较强的抑制效果。脆弱拟杆菌对水产病原菌如副溶血弧菌、灿烂弧 菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌均具有较强的抑制效果，不产生耐药性，且安全无毒。 本发明为抑制水产病原菌提供了新的选择，具有广阔的应用前景。
[0027] 以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明一实施例的脆弱拟杆菌形态图（油镜、1000X )。
[0029] 脆弱拟杆菌(Bacteroides fragiIis)ZY_312于2015年4月2日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No. 10685，保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0030] 脆弱拟杆菌（Bacteroides fragiIis)Bd312于2013年3月12日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC NO. 7280,保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述：
[0032] 参见图1，图1为本发明一实施例的脆弱拟杆菌形态图（油镜、1000 X )。本发明提供 一种脆弱拟杆菌在制备用于水产病原菌的抗菌药物中的应用。其中，所述脆弱拟杆菌包括 脆弱拟杆菌活菌体、灭活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液等。 所述水产病原菌为副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌。本实施例中， 所述脆弱拟杆菌优选为保藏号为CGMCC No . 10685的脆弱拟杆菌ZY-312，也可为保藏号为 CGMCC腸.7280的脆弱拟杆菌8(1312或脆弱拟杆菌标准株41'(^25 285。脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragiIis)ΖΥ_312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中 心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No. 10685,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)Bd312于2013年3月12日保藏于中国普通微生物菌种 保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC NO. 7280，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。
[0033] 本发明还提供了一种用于抗水产病原菌的药物组合物