，所述药物组合物含有药学 有效剂量(l〇6-l〇 1()CFU，优选为IO9CFU)的脆弱拟杆菌。其中，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆 菌活菌体、灭活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。所述脆弱拟 杆菌为保藏号为CGMCC No. 10685的脆弱拟杆菌ZY-312,也可为保藏号为CGMCC NO.7280的 脆弱拟杆菌Bd312或脆弱拟杆菌标准株ATCC25285。
[0034] 本发明还提供了一种用于抗水产病原菌的饲料添加剂，所述饲料添加剂含有脆弱 拟杆菌。所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌体、灭活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/ 或脆弱拟杆菌培养上清液。所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌，也 可为保藏号为CGMCC NO.7280的脆弱拟杆菌Bd312或脆弱拟杆菌标准株ATCC25285。下面通 过多个实施例对本发明进一步予以说明。
[0035]实施例1脆弱拟杆菌ZY-312培养 [0036] 试剂和仪器如下表所述：
[0038]培养方法
[0039] 步骤1:取一支冻干保存菌种(ZY-312、Bd-312或ATCC25285，其方法相同，故不-- 例举），加入200yL TSB培养基，复溶，吸取20yL血平皿划线，用厌氧罐气体控制系统抽气后 在生化培养箱中37°C、厌氧培养48h;
[0040]步骤2:挑取单克隆菌落接入IOmL TSB培养基，加入5% (v/v)肽牛血清，生化培养 箱中37°C、厌氧培养12h;
[00411 步骤3:取1瓶500mL TSB培养基，分别加入5%(v/v)肽牛血清，接入1%(v/v)菌种， 生化培养箱中37°C、厌氧培养48h;
[0042] 步骤4:取菌液离心，用离心机进行离心，离心条件为6000rpm、lOmin。用生理盐水 洗涤2次，最后用生理盐水复溶菌泥备用并进行活菌计数。
[0043] 步骤5:染色镜检，采用革兰氏染色法，油镜下观察，为革兰氏阴性杆菌（参见图 1)〇
[0044] 实施例2脆弱拟杆菌对水产病原菌的抑制作用
[0045] 1、病原菌平板制备
[0046] 步骤1:将副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌用TSB液体培 养基于28°C培养至0D_ = O · 8-1 · O;
[0047] 步骤2:取200yL培养液，用离心机进行离心，离心条件为6000-8000rpm，室温离心 3-5min，弃上清，沉淀用200yL无菌生理盐水重新悬浮；
[0048]步骤3:将副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌悬浮液分别涂 布在TSA固体培养基平皿，于28°C分别固定2-3h。
[0049] 2、点种
[0050] 步骤1:取培养至0D_ = 0.8-1.0的ZY-312、Bd312或ATCC25285培养液(经过病原菌 平板制备的步骤2洗涤、重悬）、生理盐水(PBS)各20yL，分别点在涂满病原菌的平板上（即上 述步骤3获得的TSA固体培养基平皿）；
[0051 ]步骤2:在生化培养箱中28-30°C培养2-3h，待点种液被培养基吸收后，置于28°C的 培养箱中倒置过夜培养24-48h。
[0052] 3、结果
[0053]对照PBS的结果，观察脆弱拟杆菌在各病原菌平板上的生长及抑菌圈的产生情况。 如下表所示，发现脆弱拟杆菌对于所检测的细菌，都产生了明显的抑菌圈。而PBS则未见明 显的抑菌圈产生。
[0054]脆弱拟杆菌与PBS对水产病原菌的抑制作用对照表
[0056] 其中，"+ + +"表示抑菌圈的直径为0.8-1.3cm; "++"表示抑菌圈的直径为0.6_ 0.8cm; 表示抑菌圈的直径为0.4-0.6cm; 表示无抑菌圈产生。上述符号在本发明其他 实施例中表达同样的含义。
[0057] 实施例3脆弱拟杆菌ZY-312对水产病原菌的抑制作用
[0058] 1、培养方法
[0059]脆弱拟杆菌ZY-312培养方法同实施例1。
[0060] 2、样品准备
[00611 1)脆弱拟杆菌ZY-312活菌体的制备
[0062] 步骤1:取一支脆弱拟杆菌ZY-312的冻干保存菌种，加入200yL TSB培养基，复溶， 吸取20yL血平皿划线，经厌氧罐气体控制系统抽气后，在生化培养箱中37°C、厌氧培养48h;
[0063] 步骤2:挑取单克隆菌落接入IOmL TSB培养基，加入5% (v/v)肽牛血清，在生化培 养箱中37°C、厌氧培养12h;
[0064] 步骤3:取1瓶500mL TSB培养基，分别加入5%(v/v)肽牛血清，接入1%(v/v)菌种， 在生化培养箱中37°C、厌氧培养48h;
[0065] 步骤4:取菌液离心，用离心机进行离心，离心条件为6000rpm、lOmin。用生理盐水 洗涤2次，最后用生理盐水复溶菌泥备用并进行活菌计数。
[0066] 2)脆弱拟杆菌灭活菌体
[0067]采用喷雾干燥机，在温度65°C进行喷雾干燥处理，获得干燥灭活菌体。取Ig菌粉溶 解于IOOmL生理盐水中。
[0068] 3)脆弱拟杆菌裂解液
[0069] ZY-312培养菌液，采用超声破碎仪进行超声破碎处理，破2秒，停5秒，持续20分钟， 获得脆弱拟杆菌裂解液。
[0070] 4)脆弱拟杆菌培养上清液
[0071] ZY-312培养菌液，用离心机进行离心，离心条件为6000印111、101^11、4°(3，离心取上 清，获得脆弱拟杆菌培养上清液。
[0072] 3、抑菌试验
[0073] 1)病原菌平板制备
[0074] 将副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌用TSB液体培养基于 28°C培养至OD6QQ = O. 8-1.0，取200yL培养液，用离心机进行离心，离心条件为6000-8000rpm 室温离心3-5min，弃上清，沉淀用200yL无菌I3BS重新悬浮。将副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧 菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌悬浮液分别涂布在TSA固体培养基于28°C，分别固定2-3h。
[0075] 2)点种
[0076] 取培养至OD6qq = 0.8-1.0的ZY-312活菌体(经过洗涤、重悬）、灭活菌体、裂解液、培 养上清、PBS各20yL，分别点在涂满病原菌的上述TSA固体培养基平板上。28-30°C培养2-3h， 待点种液被培养基吸收后，置于28°C的培养箱中倒置过夜培养24-48h。
[0077] 4、结果
[0078]对照PBS的结果，观察脆弱拟杆菌在各病原菌平板上的生长及抑菌圈的产生情况。 如下表所示，发现脆弱拟杆菌活菌体、灭活菌体、裂解液、培养上清对于所检测的细菌，都产 生了明显的抑菌圈。而PBS则未见明显的抑菌圈产生。
[0079] 脆弱拟杆菌ZY-312及PBS对水产病原菌的抑制作用对照表
[0081]由上述结果可知，脆弱拟杆菌对水产病原菌的副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、 鳗弧菌或铜绿假单胞菌均具有明显抑菌作用。其活菌体、灭活菌体、裂解液、培养上清均可 用于水产养殖类病害的防控及新型抗菌物质的开发，具有较好的应用前景。
[0082] 本发明的脆弱拟杆菌在水产养殖中的应用，通过实验第一次证明，脆弱拟杆菌对 水产病原菌如副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌均具有较强的抑制 效果，不产生耐药性，且安全无毒。同时，含有脆弱拟杆菌的用于抗水产病原菌的药物组合 物、饲料添加剂，也具有相同或相似的作用。
[0083] 当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟 悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变 形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种脆弱拟杆菌在制备用于水产病原菌的抗菌药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌体、灭 活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水产病原菌为副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈 氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌。4. 如权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC 如.10685的脆弱拟杆菌2￥-312、保藏号为0610：勵.7280的脆弱拟杆菌8(1312或脆弱拟杆菌 标准株ATCC25285。5. -种用于抗水产病原菌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有药学有效 剂量的脆弱拟杆菌。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌 体、灭活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。7. 如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC 如.10685的脆弱拟杆菌2￥-312、保藏号为0610：勵.7280的脆弱拟杆菌8(1312或脆弱拟杆菌 标准株ATCC25285。8. -种用于抗水产病原菌的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂含有脆弱拟杆 菌。9. 如权利要求8所述的饲料添加剂，其特征在于，所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌 体、灭活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。10. 如权利要求8或9所述的饲料添加剂，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏号为 CGMCCNo. 10685的脆弱拟杆菌ZY-312、保藏号为CGMCCNO.7280的脆弱拟杆菌Bd312或脆弱 拟杆菌标准株ATCC25285。
【专利摘要】一种脆弱拟杆菌在抗水产病原菌中的应用，包括脆弱拟杆菌在制备用于水产病原菌的抗菌药物中的应用及含有该脆弱拟杆菌的药物组合物及饲料添加剂。所述脆弱拟杆菌包括脆弱拟杆菌活菌体、灭活脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。本发明的脆弱拟杆菌在水产养殖中的应用，通过实验证明，脆弱拟杆菌对水产病原菌如副溶血弧菌、灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌或铜绿假单胞菌均具有较强的抑制效果，不产生耐药性，且安全无毒。同时，含有脆弱拟杆菌的用于抗水产病原菌的药物组合物、饲料添加剂，也具有相同或相似的作用。CGMCC No.1068520150402
【IPC分类】A23K20/00, A61P31/04, A61K35/741
【公开号】CN105434477
【申请号】CN201510727741
【发明人】智发朝, 白杨, 王晔, 刘洋洋, 王从峰
【申请人】广州知易生物科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年10月29日