一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，主要应用于贴壁细胞的分离培养，特别是一种皮肤细 胞损伤修复试剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一类特殊的干细胞，来源于发育 早期的中胚层和外胚层，在分类上属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，MSC 可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种组织 细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老 和病变引起的组织器官损伤修复，因其具有多向分化潜能的特性，在临床中可广泛用于多 种疾病治疗比如肝纤维化、神经损伤、脑瘫、心肌梗死等诸多疑难病症，MSC不表达主要组织 相容性复合物(MHC)II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如 ⑶80、⑶40、CD46、⑶40L，是一类免疫缺陷细胞，所以在免疫疾病方面有非常大的治疗优势， 可用于移植物抗宿主病(GVHD)，类风湿、红斑狼疮、多发性硬化病等免疫缺陷病，单纯hUC-MSC条件培养基具有造血支持功能，并促进CD34+细胞向髓系分化，所以在血液疾病方面MSC 具有很好的治疗前景，MSC是目前干细胞研究的热点之一。
[0003] MSC最初在骨髓中发现，后来经过大量深入的研究，发现MSC广泛分布于胎儿和成 体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的 间充质干细胞纯度高、数量多，且脐带的取材方便，不存在伦理问题。
[0004] 脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外覆羊膜，内含静脉、脐动脉和来自中 胚层的胶样粘液性结缔组织即沃顿氏胶。大量研究证实脐带沃顿氏胶中富含丰富的间充质 干细胞。
[0005] 当前对脐带间充质干细胞的分离方法很多，目前主要的分离方法是利用胶原酶消 化法和组织块爬片法分离脐带间充质干细胞，两种方法都存在一定的弊端，1.消化法因为 脐带的个体差异以及不可能充分进行消化，原代得到的细胞数量太少，一根脐带消化后只 能得到3-5 X IO5个细胞。消化法分离脐带间充质干细胞，存在分离时间长，成本高的问题。 2.爬片法虽然不使用胶原酶可以降低成本，但是细胞爬出时间过长，一般13-15天才可有少 量细胞爬出，影响实验的研究进度。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，本发明中透明质 酸作为细胞损伤修复试剂中的成分之一，是通过微生物发酵法生产获得，具有纯度高，产量 高等优点，可以实现大规模生产，能够满足商品化的需求。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 1、一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，其特征在于：由下列步骤组成：
[0009] ①取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清 HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗 HEV，抗-HIV-1/2，HI V-I-RNA，CMV-DNA，检测结果均为阴 性的脐带方可使用；
[0010] ②将脐带从采集瓶中取出，置于无菌平皿中，用无菌手术剪剪成5cm左右的小段；
[0011] ③将脐带段浸没于无菌烧杯中，用PBS反复清洗残留在血管内的血液，直至清洗后 的PBS基本无色为止；
[0012] ④将清洗后的脐带转移到弯盘中，使用手术剪或手术刀将其剪切成l-5mm的小块， 均匀平铺到T75培养瓶底部；
[0013] ⑤将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，干燥30分钟；
[0014] ⑥往培养瓶中缓慢加入含10%胎牛血清添加物的DMEM/F-12培养基，培养基的用 量以刚刚浸没组织块为宜；
[0015] ⑦每6天换液1次，期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待大多数组织块细胞爬 出且每个块组织块周围的细胞生长至80%左右融合时，进行脐带间充质干细胞的原代传 代；
[0016] ⑧将间充质干细胞细胞传至P4代时，按8000Cells/Cm2的密度接种于T75培养瓶 中，加入IOml DF12完全培养基；
[0017] ⑨待细胞长至80%左右融合时，用5mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；
[0018] ⑩吸尽PBS缓冲液，加入IOmL DF12培养基继续培养72小时；
[0019] (Q)收集培养72小时后的脐带间充质干细胞培养上清，将上清收集到50mL离心管 内；
[0020] ?300g，室温离心5分钟；
[0021 ] 弃沉淀，收集干细胞培养上清液，用3KD的超滤管对干细胞上清进行浓缩，浓缩 10倍，获取含有3KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；
[0022] ?将浓缩后的干细胞分泌混合因子用0.22μπι的滤膜进行过滤，置于无菌瓶中，_ 20°C保存；
[0023] @在干细胞分泌混合因子添加5g海藻糖；
[0024] @在干细胞分泌混合因子添加 Img透明质酸，获得皮肤细胞损伤修复试剂。
[0025]而且，所述海藻糖加入浓度为:5%。
[0026] 而且，所述透明质酸加入浓度为：lmg/mL。
[0027] 本发明的有益效果是：
[0028] 1、本发明中P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多，表型稳定，且能分泌大量的 混合细胞因子，能够满足大规模生产细胞损伤修复试剂的要求，从而实现将细胞损伤修复 试剂应用于临床治疗皮肤损伤修复的目的。
[0029] 2、本发明用超滤管对收集的干细胞分泌因子进行超滤浓缩，不仅截留了有效的混 合细胞因子，同时可以增加混合细胞因子的浓度，可以大大缩短皮肤损伤修复的时间，提高 皮肤损伤修复的效果。
[0030] 3、本发明中干细胞混合分泌细胞因子从干细胞培养过程中获得，由具有生物活性 的细胞分泌获得，与化学合成获得的细胞因子相比，生物活性更强，且应用于临床，具有更 低的免疫源性。
[0031] 4、本发明中皮肤相关细胞的增殖和迀移是损伤皮肤修复过程中的重要环节，通过 该发明配制的细胞损伤修复试剂，可以促进皮肤相关细胞HSF细胞的增殖和迀移，可以解决 损伤皮肤修复过程中的核心环节，为严重皮肤损伤患者减轻病痛。
【附图说明】
[0032] 图1为不同浓度的干细胞分泌混合因子能够促进Hacat(图1-1)、HSF(图1-2)细胞 的增殖；
[0033]图2为不同浓度的透明质酸在一定程度上能够促进Hacat(图2-1)、HSF(图2-2)细 胞的增殖；
[0034]图3为皮肤细胞损伤修复试剂能够促进Hacat(图3-1)、HSF(图3-2)细胞的增殖； [0035]图4为皮肤细胞损伤修复试剂能够逆转部分因双氧水诱导的损伤Hacat (图4-1)、 HSF(图4-2)细胞的增殖；
[0036]图5为皮肤细胞损伤修复试剂能够显著缩短划痕的修复时间Hacat(图5-1)、HSF (图 5-2)。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性 的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0038] 本发明提供一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，该方法由下列步骤组成：
[0039] ①取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清 HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗 HEV，抗-HIV-1/