一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多重PCR检测技术领域，特别是涉及同时检测10种腹泻病原菌的方法 和检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 感染性腹泻病是一种常见病，发病率高，尤其在儿童中，造成了巨大的疾病负担。 约10 % -40 %的感染性腹泻是由细菌性病原体引起，包括致病性大肠杆菌、志贺菌、沙门菌、 弧菌和弯曲菌等。细菌分离培养是感染实验室诊断的金标准，但是操作繁琐、耗时很长、阳 性率低，且操作人员的经验对结果的影响较大。核酸检测目前在病原检测中发挥了越来越 重要的作用，尤其PCR为基础的技术，因操作简便、耗时短、阳性率高等优势，得到广泛的重 视。普通的PCR为基础的检测体系，一般一个反应中只能检测1-3个靶标。要在更广范围内筛 查病原体，就需要进行多个反应，相应增加了检测人员的工作量、提高了检测成本。能够同 时检测多个靶标的多重PCR技术，是多病原筛查的可选手段之一。但是多重PCR技术经常难 以获得满意的效果，主要问题表现在：（1)可容纳的反应数有限:一般情况下PCR产物以凝胶 电泳进行分析，而普通凝胶电泳的区分能力差（l〇〇bp以上），为使不同靶标的扩增产物能够 明确区分，一个反应中能容纳的条带数会相对较少；（2)随着反应数的增加，体系中的引物 相应增加，更易产生引物二聚体和其它非特异性扩增，影响检测的灵敏性和特异性；（3)反 应体系中如果同时发生两个以上靶标的扩增，可能会因为靶基因特性的不同、引物组成不 同或PCR试剂间的相互作用，造成不同靶基因扩增效率不一致也就是偏爱扩增这一问题，从 而导致假阴性结果的出现。为弥补普通PCR技术的缺陷，本发明参考GenomeLab GeXP平台的 扩增策略，为常见致腹泻病原菌设计了一个多重PCR检测体系。
[0003] GenomeLab GeXP多重基因表达遗传分析系统由美国BeckmanCoulter公司和 Althea technologies公司研发，是主要用于研究多基因表达定量分析的技术平台。其核心 技术是多重PCR扩增。整个反应体系中包含两种引物，一种是由基因特异性引物和通用引物 组成的低浓度的嵌合引物，另外一种是游离于体系中的高浓度的通用引物。反应起始阶段， 扩增由嵌合引物引发；随嵌合引物的消耗，体系中游离的通用引物在整个PCR中其主要作 用。这种通用引物引发扩增的策略，有助于克服多重PCR扩增过程中的扩增偏爱性问题，并 有利于维持样品中不同靶基因的比例。通用引物5'末端标记有荧光;对PCR产物进行毛细管 电泳，根据所携带的荧光信号判断条带的位置和大小，进行多重定量检测。根据有关文献报 道，GeXP平台已广泛用于药物毒力机制研究、拟南芥与铁吸收相关多基因表达调控、癌症早 期诊断研究、免疫治疗、小鼠学习和记忆相关基因表达的多重定量分析等。在病原检测领 域，此平台曾用于建立呼吸道病毒、肠道病毒、脑炎相关虫媒病毒的检测，而在细菌性病原 体的检测方面研究较少。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种同时检测12种腹泻病原菌的多重PCR方法;本发明的 目的还在于提供一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用，以简化腹泻病原筛查的 过程，提高病原菌的检出率。
[0005]为实现上述目的，通过查阅0ΙΕ、国标、行标和相关文献，确定12种常见腹泻病病原 的致病基因或种属特异性基因，即大肠杆菌EPEC的bfpA基因、eaeA基因，大肠杆菌ETEC的 elt基因、stp基因、sth基因，大肠杆菌EHEC的stxl、stx2基因，大肠杆菌EAEC的aggR基因，大 肠杆菌EIEC的virA基因，志贺氏菌的virA基因，沙门氏菌的ompC基因，空肠弯曲菌的hipO基 因，结肠弯曲菌的ceuE基因，霍乱弧菌的ompW基因，副溶血弧菌的toxR基因，小肠结肠炎耶 尔森氏菌的ail基因。查阅文献与各种资料，引用现有的或自行设计针对以上基因的引物序 列。进行引物设计时，在GenBank数据库下载相关核酸序列，利用DNAStar、Pr imer Premiers.0等软件选取其中保守区域设计引物。除一般的引物设计原则外，根据以下标准 筛选出15对引物：（1)扩增产物大小在100bp-500bp之间；（2)不同扩增产物大小相差5bp以 上。并将SEQ ID NO. 31 -32所示的内参引物分别嵌合入上述15对特异性引物的5 '端，得到15 对特异性嵌合引物，核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1-30所示。由此，本发明首先提供了一种 同时检测上述12种腹泻病原菌的特异性嵌合引物对组合，包括以下引物对：
[0006]用于检测肠致病性大肠杆菌（enteropathogenicE·coli)EPEC的特异性嵌合引物 对的核苷酸序列如SEQIDN0.1-2、SEQIDN0.3-4所示；
[0007]用于检测肠产毒性大肠杆菌（enterotoxigenic E.coli)ETEC的特异性嵌合引物 对的核苷酸序列如SEQIDN0.5-6、SEQIDN0.7-8、SEQIDN0.9-10所示；
[0008] 用于检测肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic E·coli)EHEC的特异性嵌合引 物对的核苷酸序列如SEQIDN0.11-12、SEQIDN0.13-14所示；
[0009]用于检测肠聚集性大肠杆菌（enteroaggregativeE·coli)EAEC的特异性嵌合引 物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.15-16所示；
[00?0] 用于检测肠侵袭性大肠杆菌（enteroinvasive E.coli)EIEC和志贺氏菌 (Shigella spp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.17-18所示；
[0011]用于检测沙门氏菌（Salmonella spp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO .19-20所示；
[0012]用于检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的特异性嵌合引物对的核苷酸序 列如SEQ ID N0.21-22所示；
[0013]用于检测结肠弯曲菌(Campylobacter coli)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列 如SEQ ID N0.23-24所示；
[0014]用于检测霍乱弧菌(Vibriocholerae)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.25-26所示；
[0015]用于检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的特异性嵌合引物对的核苷酸 序列如SEQ ID N0.27-28所示；
[0016]用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的特异性嵌合引物 对的核苷酸序列如SEQ ID N0.29-30所示。
[0017] 本发明提供了上述特异性嵌合引物对组合在制备同时检测12种腹泻病原菌试剂 盒中的用途。
[0018] 本发明提供一种内参引物在与上述特异性嵌合引物对组合配合使用在制备检测 12种腹泻病原菌试剂盒中的应用，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 31 -32所示。
[0019] 本发明提供一种检测试剂盒，含有上述的特异性嵌合引物对组合和一对内参引 物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.31-32所示。
[0020] 进一步地，本发明的检测试剂盒其工作程序包括以下步骤：
[0021] (1)提取待测样品的核酸；
[0022] (2)用本发明上述特异性嵌合引物对组合和SEQ ID N0.31-32所示的内参引物，对 样品DNA进行单管一次多重PCR反应;PCR产物电泳检测，可根据如下目的产物的片段大小判 断样品中含有的病原菌种类，
[0023] 若PCR产物片段为369bp和/或274bp，则为大肠杆菌EPEC;
[0024] 若PCR产物片段为485bp和/或214bp和/或191，则为大肠杆菌ETEC;
[0025] 若PCR产物片段为225bp和/或465bp，则为大肠杆菌EHEC;
[0026]若PCR产物片段为299bp，则为大肠杆菌EAEC;
[0027]若PCR产物片段为260bp，则为大肠杆菌EIEC或志贺氏菌；
[0028]若PCR产物片段为249bp，则为沙门氏菌；
[0029]若PCR产物片段为389bp，则为空肠弯曲菌；
[0030]若PCR产物片段为424bp，则为结肠弯曲菌；
[0031] 若PCR产物片段为354bp，则为霍乱弧菌；
[0032]若PCR产物片段为413bp，则为副溶血弧菌；
[0033]若PCR产物片段为396bp，则为小肠结肠炎耶尔森氏菌。
[0034] 本发明的试剂盒中，多重PCR反应各引物在引物预混液(10X )及PCR反应液中的浓 度分别为：
[0035]
[0036] 本发明试剂盒的多重PCR反应条件为:95°C预变性15min;
[0037] 95°C30s，58-62°C90s，72°C60s，5 个循环；
[0038] 95°C30s，64-68°C9