活性尿激酶受体的检测的制作方法
【专利摘要】活性尿激酶受体的检测。本发明公开了利用AUCA或其融合蛋白检测活性uPAR的方法和AUCA或其融合蛋白在制备用于检测活性uPAR的试剂盒中的应用，以及包含AUCA或其融合蛋白的试剂盒。所述检测方法包括：1)使捕获试剂与待测样品在适合于所述捕获试剂捕获待测样品中活性uPAR的条件下接触，形成捕获试剂与活性uPAR的复合物，所述捕获试剂包括可特异性捕获活性uPAR的AUCA或其融合蛋白；2)检测被捕获的活性uPAR。本发明的方法具有较好的准确度和重现性，其检测下限达15ng/L。
【专利说明】
活性尿激酶受体的检测
技术领域
[0001] 本发明设及生物医学检测领域，具体设及对活性尿激酶受体的检测。
【背景技术】
[0002] 尿激酶受体（urokinase type plasminogen acitivator rec邱tor,uPAR)是一种 细胞表面受体。该受体由Stoppelli等于1985年发现，1989年Roldan等克隆了该cDNA，1990 年Behremlt等用亲和层析法从人淋己瘤细胞U937的细胞膜抽提液中纯化出该蛋白。在第五 次国际白细胞分化抗原会议上，uPAR被命名为分化抗原簇87(cluste;r of differentiation 87,CD87)euPAR是一种高度糖基化的表面膜蛋白，广泛表达于免疫细胞 表面，例如激活的嗜中性粒细胞、单核细胞、激活的T淋己细胞、巨隧细胞，W及多种恶性肿 瘤细胞表面，但是在绝大多数正常细胞表面表达量较低[1-5]。
[0003] UPAR是一种柔性分子，可与多种配体或受体相互作用。如玻连蛋白 (vitronectin)、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator， uPA)、低密度脂蛋白受体相关蛋白 l(low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)、整联蛋白（integrinKG蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR)等。运些不同的相互作用在人体多种生理及病理过程中发挥着广泛的重要作用，包括 纤溶酶原的激活、细胞黏附和迁移、细胞分化、化学增活现象、趋化因子受体调节、免疫应 答、炎症反应等[4,6]。证43由^个富含半脫氨酸、大小为81-87个氨基酸的1^76/证4賠吉构域 组成（Dl，D2，D3 )，分子量约为55kDaDuPAR通过其C端的糖基化憐脂酷肌醇 (glycosylphosphatidylinositol，GPI)错定在细胞膜表面[4,6]。
[0004] 尿激酶受体存在着多种的形式，包括全长的膜受体、不含穿膜区的可溶性尿激酶 受体(soluble uPAR，suPAR)、W及各种的降解片段。全长的UPAR膜受体易受憐脂酷酶C的水 解，使UPAR从细胞膜表面脱落，形成不含糖基化憐脂酷肌醇的可溶性尿激酶受体(soluble uPAR，suPAR)。另夕hPAR也对多种水解酶敏感，能够被进一步水解成Dl和D2-D3片段[3]。
[0005] 我们的前期晶体结构研究表明，UPAR通过它的S个结构域形成一个碗状结构，而 正是运个碗状结构能高效结合它的配体uPA[7]，将UPA富集在细胞表面，而将纤溶酶原激活 为纤溶酶，进而对胞外基质进行降解，在细胞迁移在发挥重要作用。同时我们的结构也证明 uPA与uPAR的结合可大大提高uPAR与玻连蛋白的结合[8]，而大量的文献也证明了uPA与 UPAR的结合对其与整合素相互作用的重要性[6,7]。运些蛋白与其他蛋白如〇曰乂6〇1111等在 病灶局部黏附、积聚，整合素受体启动细胞内信号，从而将信号从细胞外传入细胞内，激活 细胞内蛋白激酶，促进细胞分裂及细胞迁移。运种UPAR被定义为活性UPA即7]。只有有活性 的UPAR可进行信号的传导，而与肿瘤的侵袭和转移密切相关，而其他UPAR片段没有活性。目 前尚没有测定活性UPAR的方法。
[0006] 由于UPAR含量与疾病密切相关，目前市场上有很多针对UPAR的诊断方法，它们主 要是通过双抗体夹屯、法来进行检测，一般测定的是血液中有活性和非活性的总量suPAR。如 丹麦ViroGates公司推出的检测suPAR的酶联免疫吸附（enzyme-1 inked immuno sorbent assay ,ELISA)试剂盒-suPA民nostic愈尼通过了欧洲的CE-IVD(体外诊断试剂)认证，用于指 导临床。运种方法是基于总SUPAR在血液中的浓度增高预示着病人免疫系统被持续激活 [3]，总SUPAR在血液中的浓度水平也可作为病情进展的评定指标W及用于病人风险状态的 临床决策[9-11]。另外，SUPAR也可用于重症监护病房病人病情严重程度的筛选W及病人治 疗效果的评价[12，13]。具体的，SUPAR的浓度范围在0.1-4.化g/L表示受检者为正常，没有 感染或炎症反应;4-6yg/L表明受检者可能有感染，或免疫系统非正常激活需要进一步检 查；〉6yg/L表明疾病在快速进展中，需要严密监测W及跟进治疗。然而目前类似于 SiiPARnosUc皆运些抗体双夹屯、法检测到的都是血液内多种形式suPAR的总值，无法直接地 检测血液中活性uPAR的含量。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种活性UPAR的检测方法。
[000引本
【发明内容】
如下：使用活性uPAR捕获试剂(active uPAR capture agent,AUCA)或 含有它的融合蛋白捕获活性uPAR，从而实现对uPAR的检测。AUCA为尿激酶N末端片段的截断 体，通过结构分析保留其与UPAR结合相关及保持结构稳定性的片段，其序列如SEQ ID NO: 1 所示。与ATF-样，它能够特异性结合活性UPAR的活性口袋，而对无活性UPAR(如Dl和D2D3) 只有相对很弱的结合。
[0009] 所述活性UPAR捕获剂AUCA的氨基酸序列如下所示：
[0010] PSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTY HAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLV犯CMVHDCA(SEQ ID N0.1)。
[001。 本发明中所使用的术语"uPA"指尿激酶型纤溶酶原激活物。
[0012]本发明中所使用的术语"uPAR"指尿激酶型纤溶酶原激活物受体，也可称为尿激酶 受体。
[OOU]本发明中所使用的术语"suPAR"指尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的可溶形 式。
[0014] 本发明中所使用的术语"AUCA"指能够特异性捕获活性UPAR的一段蛋白序列，其氨 基酸顺序为沈Q ID NO. 1所定义的。AUCA为active uPAR cap 1:ure agent的缩写。
[0015] 本发明中所使用的术语"活性uPAR"是指结构上含S个完整结构域Dl和D2D3、功能 上能够结合天然配体UPA和玻连蛋白的uPAR。本文所述的"活性uPAR"包含全长的UPAR膜受 体、不含穿膜区的可溶性尿激酶受体(SO1 Ub 1 e uPAR，suPAR)，但不包含suPAR的各种降解片 段。
[0016] 根据本发明的一个方面，提供活性UPAR的检测方法，该方法包括：
[0017] 1)使捕获试剂与待测样品在适合于所述捕获试剂捕获待测样品中活性UPAR的条 件下接触，形成捕获试剂与活性UPAR的复合物；
[001引2)检测被捕获的活性uPAR;
[0019] 其中所述捕获试剂包含AUCA或含有AUCA的融合蛋白。
[0020] 在优选的实施方案中，本发明的检测方法是非诊断目的的，并且是在体外进行的。 在优选的实施方案中，含有AUCA的融合蛋白是AUCA-HSA融合蛋白。"适合于所述捕获试剂捕 获待测样品中活性uPAR的条件"包括合适的溫度、反应时间和溶液等，W避免蛋白质变性， 并使捕获试剂与活性UPAR特异性结合。合适的条件取决于选择的具体检测系统和/或具体 检测方法，本领域技术人员基于其所掌握的一般知识能够选择适合于不同检测系统和/或 具体检测方法的条件。
[0021] 可W通过本领域技术人员熟知的具体检测系统和/或具体检测方法对被捕获的活 性UPAR进行检测。所选择的具体检测方法可W是异质或同质测定法。异质测定法是包括一 次或多次清洗步骤的测定法，而在同质测定法中，此类清洗步骤不是必需的，仅将检测试剂 和待检测样品混合并测量。所述测定方法包括但不限于基于化ISA(酶联免疫吸附测定法） 的测定法、DELFIA(解离增强铜系元素巧光免疫测定法）、SPA(闪烁邻近测定法）、 Flashplate测定法、FRET(巧光共振能量转移)测定法、TR-FRET(时间分辨巧光共振能量转 移)测定法、FP (巧光偏振)测定法、ALPHA(放大化学发光亲合均相检测）、EFC (酶片段互补） 测定法、双杂交测定法或共免疫沉淀测定法。
[0022] 在进一步的实施方案中，在上述活性UPAR的检测方法中，步骤2)可W包括使所形 成的复合物与特异性结合被捕获的活性UPAR的试剂结合，并通过检测所述特异性结合被捕 获的活性UPAR的试剂来检测被捕获的活性uPAR。
[0023] 在上述测定过程中，可W通过对反应体系中所包含的检测成分的测定来实现对被 捕获的活性UPAR进行检测。所述检测成分包括捕获试剂(例如捕获试剂中所含有的AUCA或 其融合蛋白）和/或与被捕获的活性UPAR特异性结合的试剂。对检测成分的测定可W通过使 用可检测的标记成分进行标记并检测标记成分来进行。可检测的标记成分根据具体使用的 测定方法而有所不同。本发明中，可W W多种方式，例如但不限于用生物素、酶、巧光染料 (如FITC、巧光素、罗丹明、切染料或Alexa fluor)，来标记检测成分，也可W使用放射性标 记物(如化、32P、35S、i25I或I4C)及常见的酶标记物如辣根过氧化物酶和碱性憐酸酶来进行 标记。例如，可W将标记成分标记在与被捕获的活性uPAR特异性结合的试剂上，通过检测标 记成分实现对被捕获的活性UPAR的检测;也可W将成对的标记成分中的一个标记在捕获试 剂上，另一个标记在与被捕获的活性UPAR特异性结合的试剂上，通过成对的标记成分之间 的相互作用的检测实现对被捕获的活性UPAR的检测；还可W将标记成分标记在捕获试剂 上，捕获试剂与活性UPAR的结合会导致捕获试剂上的标记成分发生变化，通过检测标记成 分的变化实现对被捕获的活性UPAR的检测;运些标记成分及其检测方法都是本领域技术人 员熟知的。
[0024] 在一些优选的实施方案中，特异性结合被捕获的活性UPAR的试剂是结合于活性 UPAR外侧的单克隆抗体。运类抗体可W通过利用活性UPAR蛋白免疫动物得到多克隆抗体， 而后经uPAR-AUCA亲合柱捕获而得。
[0025] 在更优选的实施方案中，所述结合于活性UPAR外侧的单克隆抗体是用UPAR D2D3 (氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗UPAR抗体。
[0026] 在更加优选的实施方案中，所述结合于活性UPAR外侧的单克隆抗体是抗体ATN- 658。
[0027] 本文使用的术语"单克隆抗体"指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中 包含的单个抗体是相同的，除了少数可能存在的天然发生的突变之外，单克隆抗体高特异 性地针对单个抗原表位。制备特定抗原的单克隆抗体的方法是本领域公知的，例如通过杂 交瘤方法获得。本发明所述"结合于活性uPAR外侧的单克隆抗体"是指所针对的抗原表位位 于活性UPAR外侧的单克隆抗体。所述"活性UPAR外侧"是活性UPAR上相对于AUCA所插入的活 性疏水性口袋的内侧而言的外侧上的位点。活性UPAR与AUCA结合情况下，与其外侧位点结 合的单克隆抗体可W与所形成的复合物相结合，从而可W实现对被捕获的活性UPAR的检 。鉴定单克隆抗体所针对的抗原表位的方法是本领域公知的，因此本领域技术人员可W 通过其所熟知的方法确定单克隆抗体是否与活性UPAR外侧相结合。
[0028] 对该单克隆抗体的测定可W通过使用可检测的标记成分对检测成分进行标记并 检测标记成分来进行。检测成分包括捕获试剂(含有AUCA或含有AUCA的融合蛋白）、结合于 活性UPAR外侧的单克隆抗体和/或与该单克隆抗体结合的二抗。例如，可W将标记成分标记 在单克隆抗体上，通过检测标记成分实现对被捕获的活性UPAR的检测；也可W使单克隆抗 体与二抗结合，将标记成分标记在二抗上，通过检测标记成分实现对被捕获的活性UPAR的 检测;还可W将成对的标记成分中的一个标记在捕获试剂上，另一个标记在该单克隆抗体 或与该单克隆抗体结合的二抗上，通过成对的标记成分之间的相互作用的检测实现对被捕 获的活性UPAR的检测;还可W将标记成分标记在捕获试剂上，捕获试剂与活性UPAR的结合 会导致捕获试剂上的标记成分发生变化，通过检测标记成分的变化实现对被捕获的活性 UPAR的检测;运些标记成分及其检测方法都是本领域技术人员熟知的。可检测的标记成分 包括但不限于生物素、酶、巧光染料(如FITC、巧光素、罗丹明、切染料或Alexa f Iuor)、放射 性标记物(如3h、32p、35s、i25i或及常见的酶标记物如辣根过氧化物酶和碱性憐酸酶。
[0029] 在更加优选的实施方案中，本发明的检测方法的具体步骤如下：
[0030] (1)向多孔板的孔内加入IOOyl经包被液稀释的AUCA-HSA蛋白溶液（140iig/ml)进 行包被，4 °C过夜，洗涂并干燥；
[0031] (2)向孔中加入10化1封闭液进行封闭，室溫80转/分，解育1小时，洗涂并干燥；
[0032] (3)向一些孔中加入不同浓度的活性UPAR标准品10化1，所述不同浓度分别为化g/ L、0.扣g/L、0.25iig/L、0.125iig/L、0.062扣g/L、0.0312扣g/l;向另一些孔中加入 100山的样 品稀释液作为空白对照，空白对照中不含有uPAR;向其它孔中加入待检样品的用样品稀释 液稀释10倍的稀释液;室溫80转/分，解育1小时，洗涂并干燥；
[0033] (4)向所有孔内加入I(K)山9μg/ml经样品稀释液稀释的鼠抗人源UPAR的单克隆抗 体，室溫80转/分，解育1小时，洗涂并干燥，其中所述单克隆抗体是用UPAR D2D3(氨基酸 88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗UPAR抗体；
[0034] (5)向所有孔内加入10化1经样品稀释液500倍稀释的碱性憐酸酶标记的抗鼠 IgG, 室溫80转/分，解育1小时，洗涂并干燥；
[0035] (6)向每孔内加入10化1显色液，接着将酶标板置于酶标仪上于405皿读取吸光度， 共读取60min，每Imin读取一次吸光度值；
[0036] (7)制作标准曲线，计算样品中活性UPAR的浓度。
[0037] 根据本发明的另一个方面，提供AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制备用于检测样品 中活性UPAR的试剂中的应用。
[0038] 在本发明中，"待测样品"包括但不限于来自于受试者的血液、血清、血浆细胞培养 液、唾液和尿液。
[0039] 本发明中所使用的术语"融合蛋白"指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序 列的嵌合蛋白。制备融合蛋白的方法是本领域公知的，通常融合蛋白由本领域熟知的体外 重组技术产生。本发明的"含有AUCA的融合蛋白"是AUCA与另一种蛋白质或多肤或其片段的 嵌合蛋白。所述另一种蛋白质或多肤或其片段可W是血清白蛋白，例如人血清白蛋白 化SA)、牛血清白蛋白（BSA)，也可W是卵清蛋白（OVA)。在优选的实施方案中，含有AUCA的融 合蛋白是AUCA-服A融合蛋白。
[0040] 本发明中，可W通过本领域已知的各种方法制备AUCA、或含有AUCA的融合蛋白，例 如可W通过化学合成或重组方法制备。在优选的实施方案中，本发明的AUCA或含有AUCA的 融合蛋白是重组蛋白。
[0041] 所述AUCA或含有AUCA的融合蛋白可W被固定在固体基质上。所述固体基质包括但 不限于多孔板(如96孔板）、蛋白质忍片底膜(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等）、磁珠等。
[0042] 根据本发明的另一个方面，提供AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制备用于检测样品 中活性UPAR的试剂盒中的应用。在优选的实施方案中，所述试剂盒包含捕获试剂，所述捕获 试剂包括可特异性捕获活性UPAR的AUCA或含有AUCA的融合蛋白。
[0043] 根据本发明的一个方面，提供用于检测活性UPAR的试剂盒，所述试剂盒包含捕获 试剂，所述捕获试剂包括可特异性捕获活性UPAR的AUCA或其融合蛋白。
[0044] 在一些实施方案中，所述捕获试剂被可检测的标记成分标记。捕获试剂与活性 UPAR的结合会导致捕获试剂上的标记成分发生变化，通过检测捕获试剂上的标记成分的 变化可W实现对被捕获的活性UPAR的检测。
[0045] 在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测被捕获的活性UPAR的一种或多 种试剂。在优选的实施方案中，所述用于检测被捕获的活性UPAR的一种或多种试剂包括结 合于活性UPAR外侧的单克隆抗体和/或与该单克隆抗体结合的二抗。在一些实施方案中，所 述单克隆抗体被可检测的标记成分标记。在另一些实施方案中，所述单克隆抗体未被可检 测的标记成分标记。在一些实施方案中，所述二抗被可检测的标记成分标记。在另一些实施 方案中，所述二抗未被可检测的标记成分标记。
[0046] 在优选的实施方案中，所述结合于活性UPAR外侧的单克隆抗体是UPAR D2D3(氨基 酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗UPAR抗体。
[0047] 在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测被捕获的活性UPAR的一种或多 种试剂，其中所述捕获试剂被可检测的成对标记成分中的一个成分标记，并且用于检测被 捕获的活性uPAR的一种或多种试剂被成对标记成分中的另一个标记。通过检测成对标记成 分之间的相互作用可W实现对被捕获的活性UPAR的检测。在优选的实施方案中，所述用于 检测被捕获的活性UPAR的一种或多种试剂包括结合于活性UPAR外侧的单克隆抗体和/或与 该单克隆抗体结合的二抗。
[0048] 在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含任何适用于检测被捕获试剂捕获的活性 UPAR的可检测的标记成分。
[0049] W上所述的可检测的标记成分包括但不限于生物素、酶、巧光染料(如FITC、巧光 素、罗丹明、切染料或416义3門11〇')、放射性标记物(如化、3申、355、1251或1 4〇^及常见的酶 标记物如辣根过氧化物酶和碱性憐酸酶。
[0050] 在一些实施方案中，在本发明的试剂盒中，捕获试剂可W被固定在固相基质上，例 如被固定在多孔板(如96孔板）、蛋白质忍片底膜(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等）、磁珠上。 试剂盒中还可W包含包被液、封闭液、洗涂液、样品稀释液、W及用于检测标记成分的试剂 中的一种或多种。
[0051] 上述试剂盒还可W包括使用说明书。
[0052] 在优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含：酶标板;AUCA-HSA蛋白溶液；活性 UPA財示准品；用人UPAR D2D3 (氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆 抗UPAR抗体;碱性憐酸酶标记的抗鼠 IgG;包被液;洗涂液/样品稀释液;封闭液和显色液。
[0053] 在更优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含:酶标板；Iml 1.4mg/ml的AUCA-HSA 蛋白溶液；Iml活性UPAR标准品（Img/ml); IOOiil用UPAR D2D3(氨基酸88-283)免疫小鼠，经 杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗uPAR抗体(0.9mg/ml); 2扣1 500 X碱性憐酸酶标记的抗 鼠 IgG;包被液IOml; 30 X洗涂液/样品稀释液20ml;BSA封闭液IOml;PNPP显色液IOml。
[0054] 本发明中，包被液优选为含40mMNaHC03，10mM化2C03，pH9.6的水溶液。
[0055] 本发明中，封闭液优选为用包被液配制的5%BSA溶液。
[0056] 本发明中，洗涂液/样品稀释液优选为含0.5%oTween-20pH7.4的PBS溶液，其中 ?85配方为船(：18邑/1，1((：10.2邑/1，船2册〇4*12出0 3.58邑/1，1(出口〇4〇.27邑/1。
[0化7]本发明中，显色液优选含有0.ImM Tris ? HCKpH 9.5),0.ImM 化Cl,5mM MgCl2， 2mg/ml PNPPo
[0058] 使用本发明的检测方法和检测试剂盒，可特异地检测各种样本中的活性uPAR。
[0059] 本发明中所使用的"包含"、"包括"或"含有"可W指"包括但不限于"、"基本由…… 组成"或"主要由……组成"。
[0060] 在本发明中使用"包含"、"包括"或"含有"的技术方案还可W是由所列成分组成的 技术方案。
【附图说明】
[006。 图1是实施例1的活性UPAR的ELISA检巧巧法的设计原理示意图。
[0062] 图2是实施例1中所使用的96孔化ISA检测板典型示例。
[0063] 图3是不同浓度活性UPAR标准品的吸光度随时间变化的动力学过程图。
[0064] 图4是活性UPAR浓度对应酶反应速度的标准曲线。
[0065] 图5是本发明活性UPAR的化ISA检测方法的回收率计算结果。
【具体实施方式】
[0066] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但提供运些实施例是为了帮助理解 本发明，本发明不限于运些实施例。
[0067] W下为实施例中设及使用的试剂及实验材料：
[006引 AUCA-HSA:使用与专利201410034942.1类似的方法制备AUCA-HSA融合蛋白，经 SDS-PAGE电泳验证纯度大于90%。也可W通过本领域技术人员熟知的其它方法制备AUCA和 HSA的融合蛋白，例如在己斯德毕赤酵母X-33中表达并经儀-次氮基S乙酸(Ni-NTA)柱纯 化。
[0069] 活性UPAR标准品：在S2果蛹胚胎细胞中表达的重组suPAR，经亲合柱结合离子柱纯 化。
[0070] 抗体ATN-658:由Attenuon，LLC(SanDiego，Calif)提供，是uPARD2D3(氨基酸88- 283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗uPAR抗体。
[0071 ]碱性憐酸酶标记二抗（AP-antimouse-IgG):选购于Cell Si即aling Technology 公司，是专用于Western blotting和ElLISA中的酶标二抗。
[0072] 96孔酶标板:选购于化ermo scientific公司，是透明的Maxiso巧类型酶标板。
[0073] 包被液:含40mMNa肥03，10mM化2C03，pH9.6的水溶液。
[0074] 封闭液:用包被液配置的5%BSA溶液，其中BSA选购于生工生物工程有限公司。
[0075] 洗涂液/样品稀释液：含0.5%〇Tween-20pH 7.4的PBS溶液，其中PBS配方为化Cl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HP〇4? 12出0 3.58g/L，K出P〇4 0.27g/L。
[0076] 显色液：0.1mM Tris ?肥 1(抑 9.5)，0.1mM NaCl，5mM MgCl2,2mg/ml PNPP。
[0077] 实施例一:利用AUCA-HSA来检测人血样中的活性uPAR
[0078] 本实施例中活性UPAR的化ISA检测方法的原理如图1所示。
[0079] 血浆样品的收集和保存:收集人的全血于含抓TA抗凝剂的真空采血管中，在1200* g离屯、30min。将不同病人的血浆编号并用样品稀释液稀释10倍，分装于1.5ml离屯、管中，保 存在-80°C待用。
[0080] 具体的操作步骤如下：
[0081 ] 1包被：向酶标板的1A-12H所有孔（参见图2)内加入10化1经包被液稀释的AUCA- 服A蛋白溶液(140iig/ml)，用密封胶带将96孔板密封好W防止液体蒸发，并于4°C过夜。掲开 密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最后一次洗涂 后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
[0082] 2封闭：向酶标板内1A-12H所有孔中加入10化1封闭液，并用密封胶带将96孔板密 封好W防止液体蒸发，于室溫80转/分的摇床上解育1小时。掲开密封胶带，甩干酶标板孔内 的液体，并用排枪吸取洗涂液洗涂每孔6次，在最后一次洗涂后，将酶标板在吸水纸上轻轻 拍干并保证孔内没有气泡存留。
[0083] 3加样:分别向酶标板1A-1F加入不同浓度的活性UPAR标准品10化1，每一浓度有两 个复孔(Al、A2: liig/L;Bl、B2:0.5iig/L;Cl、C2:0.2扣g/l;Dl、D2:0.12扣g/l;El、E2:0.0625y g/レFl、F2:0.03125iig/L)。向Gl、G2分别加入10化l的样品稀释液作为空白对照。然后向酶 标板内其它孔加入待检测病人的稀释血清样品（用样品稀释液稀释10倍），每个血清样品2 个重复，然后用密封胶带将96孔板密封好，并于室溫80转/分钟的摇床上解育1小时。掲开密 封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最后一次洗涂后， 将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
[0084] 4加一抗：向酶标板1A-12H所有孔内加入10化1 9iig/ml经样品稀释液稀释的鼠抗 人源UPAR的ATN-658抗体，并用密封胶带将96孔板密封好，并于室溫80转/分钟的摇床上解 育1小时。掲开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最 后一次洗涂后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
[0085] 5加酶标二抗：向酶标板1A-12H所有孔内加入10化1经样品稀释液500倍稀释的碱 性憐酸酶标记的抗鼠 IgG(antimouse-AP con化gate IgG)，并用密封胶带将96孔板密封好， 并于室溫80转/分钟的摇床上解育1小时。掲开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪 吸取洗涂液，洗涂每孔6次，然后在用排枪吸取去离子水洗涂每孔3次。将酶标板在吸水纸上 轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
[0086] 6加显色液:然后用排枪向每孔内快速加入10化1显色液，接着将酶标板置于酶标 仪上于405nm读取吸光度，共读取60min，每Imin读取一次吸光度值。
[0087] 7制作标准曲线，计算血液样品中活性UPAR的浓度。
[008引首先，通过线性回归分析的方法建立一系列活性UPAR浓度(X轴）与对应的酶反应 速度-Rate(Y轴）的标准曲线。图3就是酶标仪于405nm读取不同浓度活性UPAR标准品的吸光 度随时间变化的动力学过程，其中横坐标为时间（监测60分钟），纵坐标为405nm处的吸光 值，动力学曲线由上至下对应的活性UPAR浓度依次为：liig/L，0.5iig/L，0.2扣g/L，0.12扣g/ L，0.062化g/L，0.0312扣g/L，0yg/L。通过不同活性uPAR浓度对应的第60分钟OD 405nm处 吸光值减去第1分钟0 D 4 0 5 n m处的吸光值，得到6 0分钟时间内的0 D 4 0 5 n m的变化值X (miIliAbsorbance ,milIiAbs)。用邱余W60分钟即得到不同活性uPAR浓度对应的酶反应速 度(milliAbs/min)。图4即为一系列活性UPAR浓度对酶反应速度所做标准曲线。通过换算将 病人血浆样本对应的酶反应速度带入标准曲线即可测定对应血浆样品中的活性uPAR含量。
[0089] 实施例二:活性UPAR检测方法的性能表征
[0090] 本实施例是对本发明的活性UPAR的化ISA检测方法的考核，如未作特殊说明，具体 的实验方法和所用试剂同实施例1所述方法。
[0091] (1)精密度实验
[0092] 精密度通常用批内和批间变异系数(CV% )来表示，应用实施例一的化ISA方法对 于同一个血浆样品中的活性UPAR含量在同一天同一块板中重复测量16次得到相应的平均 值(AVE)和标准差(SD)，通过公式100%*(SD/AVE)即得到相应的批内变异系数（％)，结果如 表一所示。另外在连续4天内每天重复测量同一个血浆样品中的活性UPAR含量，得到相应4 天的平均值(AVE'）和标准差（SD'），通过公式100%*(SD'/AVE'）即得到相应的批间变异系 数（％ )，结果如表二所示。由表一和表二可看到批内变异系数为8.27%，小于10%，批间变 异系数为9.52%，小于15%，说明了所建立的ELISA新方法重现性良好。
[0093] 表一批内精密度测定结果： rn〇94i Luuy/j 凹H乂头避
[0098]回收实验的回收效果一般用回收率（％ )来表示。将IOiil -系列已知浓度的活性 UPA財示准样品分别加入到10化1样品稀释液或者稀释10倍的血浆中，并分别计算出11化1体 系中最终添加的活性UPAR浓度(此浓度记为活性UPAR添加浓度）。然后应用本化ISA方法分 别检测加入活性UPAR的样品稀释液和稀释的血浆中活性UPAR浓度(此浓度记为活性UPAR检 测浓度））。分别绘制针对样品稀释液的活性UPAR添加浓度和活性UPAR检测浓度W及针对 稀释血浆的活性UPAR添加浓度和活性UPAR检测浓度的线性关系图，结果如图5所示。通过对 比两曲线的斜率值来计算标准样品在血浆中的回收率R，其中针对样品稀释液的活性uPAR 添加浓度和活性UPAR检测浓度的线性方程的斜率被认为是100%的回收率。因此活性UPAR 在血浆中的回收率R二1.0102/1.0165二99.4%，也表明了此化ISA方法具有较好的准确度。
[0099] (3)检测限^及标准曲线的线性范围
[0100] 为了确认本化ISA方法检测活性UPAR含量的检测下限，通过测量4组空白对照（加 入样品为样品稀释液，活性UPAR浓度为Otig/L)中相应的酶反应速度，然后带入到活性UPAR 浓度和酶反应速度的标准曲线中，得到相应活性UPAR的含量。计算出四组空白对照中活性 UPAR含量的平均值(AVE" ) W及相应的标准差(SD")。此方法的检测下限可通过公式AVE"+3* SD"得到，由此获得本ELISA方法的活性UPAR含量的检测下限约为15ng/L。另外通过绘制0- 12如g/L活性UPAR浓度对应酶反应速度的线性关系图，我们发现本方法的线性范围为0-如 g/U线性方程中1?2〉〇.99被认为线性关系较好）。
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【主权项】
1. 活性uPAR的检测方法，该方法包括： 1) 使捕获试剂与待测样品在适合于所述捕获试剂捕获待测样品中活性uPAR的条件下 接触，形成捕获试剂与活性uPAR的复合物； 2) 检测被捕获的活性uPAR; 其中所述捕获试剂包含AUCA或含有AUCA的融合蛋白，优选包含AUCA-HSA融合蛋白。2. 权利要求1的检测方法，其中步骤2)包括使所形成的复合物与结合于活性uPAR外侧 的单克隆抗体结合，并通过检测所述单克隆抗体来检测被捕获的活性uPAR，优选所述结合 于活性uPAR外侧的单克隆抗体是用uPAR D2D3免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克 隆抗uPAR抗体。3. 根据权利要求1的检测方法，其中具体步骤如下： (1)向多孔板的孔内加入1〇〇μ1经包被液稀释的140μg/ml的AUCA-HSA蛋白溶液进行包 被，4°C过夜，洗涤并干燥； ⑵向孔中加入?〇〇μ1封闭液进行封闭，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥； (3) 向一些孔中加入不同浓度的活性uPAR标准品100μΙ，所述不同浓度分别为lyg/L、 0.5yg/L、0.25yg/L、0.125yg/L、0.0625yg/L、0.03125yg/L;向另一些孔中加入100μΙ的样品 稀释液作为空白对照，空白对照中不含uPAR;向其它孔中加入待检样品的用样品稀释液稀 释10倍的稀释液;室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥； (4) 向所有孔内加入100μΙ 9μg/ml经样品稀释液稀释的鼠抗人源uPAR的单克隆抗体， 室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥，其中所述单克隆抗体是用uPAR D2D3免疫小鼠，经杂 交瘤技术筛选而得到的单克隆抗uPAR抗体； (5) 向所有孔内加入IOOyl经样品稀释液500倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗鼠 IgG，室温 80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥； (6) 向每孔内加入IOOyl显色液，接着将酶标板置于酶标仪上于405nm读取吸光度，共读 取60min，每Imin读取一次吸光度值； (7) 制作标准曲线，计算样品中活性uPAR的浓度。4. 权利要求1-3任一项的检测方法，其中待测样品可以但不仅限于血液、血清、血浆、细 胞培养液、唾液和尿液。 5 .AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制备用于检测样品中活性uPAR的试剂中的应用。 6. AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制备用于检测样品中活性uPAR的试剂盒中的应用。7. 根据权利要求5或6的应用，其中含有AUCA的融合蛋白是AUCA-HSA融合蛋白。8. 用于检测活性uPAR的试剂盒，所述试剂盒包含捕获试剂，所述捕获试剂包含可特异 性捕获活性uPAR的AUCA或含有AUCA的融合蛋白，优选包含AUCA-HSA融合蛋白。9. 权利要求6的应用或权利要求8的试剂盒，其中所述试剂盒还包含结合于活性uPAR外 侧的单克隆抗体和/或与该单克隆抗体结合的二抗，优选所述结合于活性uPAR外侧的单克 隆抗体是uPAR D2D3免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗uPAR抗体。10. 权利要求6的应用或权利要求8的试剂盒，其中所述试剂盒包含:酶标板;AUCA-HSA 蛋白溶液;活性uPAR标准品；用人uPAR D2D3免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆 抗uPAR抗体;碱性磷酸酶标记的抗鼠 IgG;包被液;洗涤液/样品稀释液;封闭液和显色液； 优选所述试剂盒包含：酶标板；Iml 1.4mg/ml的AUCA-HSA蛋白溶液；Iml活性uPAR标准 品（lmg/ml);100yl 0.9mg/ml的用uPAR D2D3免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆 抗uPAR抗体;25μ1 500 X碱性磷酸酶标记的抗鼠 IgG;包被液IOml; 30 X洗涤液/样品稀释液 20ml ;BSA封闭液IOml，ΡΝΡΡ显色液IOml。
【文档编号】G01N33/68GK105954522SQ201610541379
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】黄明东, 周晓雷, 许明明, 袁彩
【申请人】中国科学院福建物质结构研究所