专利名称：抗胆碱能m3型受体抗体测定在干燥综合征诊断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗抗胆碱能M3型受体抗体作为抗原在检测干燥综合征及其它疾病中的应用。
一、技术背景干燥综合征(Sjgren’s Syndrome，SS)是一种以侵及泪腺和唾液腺等外分泌腺为特征的全身性自身免疫疾病。该病最常见的临床表现为眼干、口干，并可累及肺、肾脏、淋巴系统、血管及肝脏等器官。此病无明显的地区分布差异，可发生于任何年龄，以40-60岁，特别是绝经后的女性居多，男女之比为1∶9。在我国的患病率为0.77％，在老年人群中的患病率高达4％，全国有近1000万患者。
近年来，人们对干燥综合征的病因及发病机理进行了大量研究，但至今无突破性进展。目前在临床上尚未发现理想的血清学诊断方法，除临床症状外，主要靠唇腺活检及腮腺造影等有创检查明确诊断，由于患者的医从性差，常常延误诊断，并丧失最佳的治疗时机。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的检测方法，对干燥综合征的诊断及治疗具有重要意义。为此，本发明人经过多年研究发现了可以用于干燥综合征诊断的血清学特异性抗原——抗胆碱能M3型受体，该蛋白可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体——抗胆碱能M3型受体抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如免疫印迹法)检测出来，并且具有很高的敏感性和特异性。
二、发明概述本发明目的是提供有效检测干燥综合征特异性抗原的检测方法，并应用于干燥综合征的诊断。
胆碱能M3型受体是一种主要分布于外分泌腺及平滑肌的胆碱能受体，也是一种G-蛋白偶联受体。它结合胆碱能神经释放的神经递质——乙酰胆碱，激活磷脂酶C、A2、D通路，电压依赖性钙通道开放，使钙内流增加，细胞内钙的浓度升高，cAMP增加，引起腺体分泌和平滑肌收缩。近年来的研究发现SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体可以识别并激活M3型受体，该抗体与M3型受体的长期结合，不仅降低胆碱能M3型受体对乙酰胆碱的敏感性，还造成M3型受体的进行性破坏，导致受体的降解，进而影响信号传导通路、干扰水通道蛋白的分布，致使SS患者出现腺体分泌减少、膀胱逼尿肌收缩力减弱等胆碱能神经功能异常的临床表现。
1996年，Bacman等报道[1]了SS患者血清中存在着抗胆碱能M3型受体抗体，并进一步指出该抗体对于SS的诊断具有较高的特异性。但是至今为止，国内尚没有开展抗胆碱能M3型受体抗体与干燥综合征关系的研究，国外也没有这方面大样本的临床研究，而且国内、外都没有建立切实可行的该抗体的临床检测方法。
以往人们认为胆碱能M3型受体的抗原表位位于其细胞外第二环，但是，发现使用M3型受体细胞外第二环多肽检测SS患者血清中抗胆碱能M3型受体抗体方法的重复性不佳[2]。一些研究提出胆碱能M3型受体可能为构象型抗原表位[3]，因而提示抗胆碱能M3型受体抗体很可能识别的是M3型受体蛋白质的空间结构。因而本研究选择真核表达的重组胆碱能M3型受体蛋白作为抗原基质，通过免疫印迹(Western Blot)的方法检测SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体。该蛋白是一种用于检测受体与配体结合能力的蛋白，本研究在国内外首次证实该蛋白可以用于检测抗胆碱能M3型受体抗体。并评价该抗体对SS诊断的敏感性和特异性，了解该抗体与SS临床表现及其它自身抗体的关系。
本发明的抗胆碱能M3型受体抗体可以通过多种方法(例如免疫印迹法、斑点法、酶联免疫吸附法、金标记法等)对干燥综合征患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知。同时，检测的抗胆碱能M3型受体抗体类型可为IgG型、IgA型或其他类型的免疫球蛋白。
本发明所述的胆碱能M3型受体可以用本领域人员所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表达纯化法等。
图1.免疫印记法检测原理。首先将胆碱能M3型受体进行Tris-HCL SDS-PAGE，然后将其转移到硝酸纤维膜上，脱脂牛奶封闭过夜。将其与待测血清一起孵育，如果血清中存在抗胆碱能M3型受体抗体，该抗体就会与硝酸纤维膜上的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。将未结合的抗体及其它成份冲洗去除后，与生物素标记的山羊抗人IgG共同孵育。再洗去未结合的成份，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素一起温育。洗去未结合的成份，加入二氨基联苯胺(DAB)显色。若血清中含有抗胆碱能M3型受体抗体，在硝酸纤维膜上抗原所在特定位置上显示出颜色，且抗体滴度越高颜色越深。
图2.重组胆碱能M3型受体蛋白电泳。蛋白纯度为95％。10％ Tris-HCL SDS-PAGE，考马斯亮兰R250染色。显示分子量为70kD的重组胆碱能M3型受体蛋白。
图3.免疫印迹法(Western Blot)检测抗胆碱能M3型受体抗体。检测结果显示已知的抗胆碱能M3型受体的多抗与重组胆碱能M3型受体蛋白发生了特定的抗原抗体反应，出现特异性阳性条带(A)；而阴性对照则无该条带(B)。
图4.抗胆碱能M3型受体抗体与SS患者血清及对照组血清反应。结果显示山羊抗人抗胆碱能M3型受体多抗(膜条1)与抗胆碱能M3型受体反应呈阳性；干燥综合征患者(膜条2-12)血清与重组胆碱能M3型受体蛋白发生抗原抗体反应，出现阳性条带；而疾病对照组(条带13)及正常对照(条带14)组与该蛋白无反应，无条带。
图5.抗胆碱能M3型受体抗体在不同风湿性疾病的阳性率。应用免疫印迹法检测80例SS患者，其中67例抗胆碱能M3型受体抗体阳性，阳性率为83.8％；在40例类风湿关节炎(RA)患者中无阳性出现；在40例系统性红斑狼疮(SLE)患者中仅2例阳性，阳性率为5％；40名正常对照组中，有1例阳性。SS组抗胆碱能M3型受体抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。抗胆碱能M3型受体抗体在SS患者的敏感性为83.8％，特异性为97.5％。
图6.抗胆碱能M3型受体抗体与其他自身抗体敏感性及特异性比较。在80例SS患者中对各种抗体的比较可以看出，抗胆碱能M3型受体抗体的敏感性高于抗SSA、SSB及抗α-胞衬蛋白抗体，差异有统计学意义(p＜0.01)；抗胆碱能M3型受体抗体在诊断SS的特异性方面，优于抗SSA和抗SSB，差异有统计学意义(P＜0.01；P＜0.05)；抗胆碱能M3型受体抗体的特异性高于抗α-胞衬蛋白抗体，差异无统计学意义(P＞0.05)。
图7.抗胆碱能M3型受体抗体在其他抗体阴性的SS患者的阳性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞衬蛋白抗体阴性的SS患者中，72％-81％出现抗胆碱能M3型受体抗体阳性。特别是在抗SSA抗体阴性的SS患者中，抗胆碱能M3型受体抗体的阳性率达80.0％，对SS的诊断中更有意义。
图8.抗胆碱能M3型受体抗体在其他抗体阳性的SS患者的阳性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞衬蛋白抗体阳性的SS患者中，出现抗胆碱能M3型受体抗体阳性率分别为87.5％、88.2％、85.4％。
以下通过实施例进一步说明本发明，但下列实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1胆碱能M3型受体的鉴定胆碱能M3型受体是一种主要分布于外分泌腺及平滑肌的胆碱能受体，也是一种G-蛋白偶联受体。近年来的研究发现SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体可以识别并激活M3型受体。以往人们认为胆碱能M3型受体的抗原表位位于其细胞外第二环，但是，发现使用M3型受体细胞外第二环多肽检测SS患者血清中抗胆碱能M3型受体抗体方法的重复性不佳[8]。一些研究提出胆碱能M3型受体可能为构象型抗原表位[28]，因而提示抗胆碱能M3型受体抗体很可能识别的是M3型受体蛋白质的空间结构。因而本研究选择真核表达的重组胆碱能M3型受体蛋白作为抗原基质，通过免疫印迹(Western Blot)的方法检测SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体。该蛋白是一种用于检测受体与配体结合能力的蛋白，本研究在国内外首次证实该蛋白可以用于检测抗胆碱能M3型受体抗体。
本研究从从sigma公司购进sf9细胞真核表达的人胆碱能M3型受体蛋白，序列为gggcaatggc......agcaaaaaaa aaaaaaa，(引自Gene bank gi54792120)通过SDS-PAGE及免疫印迹法对其进行鉴定。
将购得的蛋白进行SDS-PAGE，并进行凝胶染色，结果在70KD处出现明显条带，与预期一致。(见图2)用抗胆碱能M3型受体多抗与重组胆碱能M3型受体蛋白进行免疫印迹法检测，结果出现了阳性条带，而阴性对照组无条带。(见图3)。
由此说明抗胆碱能M3型受体多抗可与重组胆碱能M3型受体结合，可以尝试应用与检测SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体。
实施例2干燥综合征患者和对照组血清中抗胆碱能M3型受体抗体的检测采用本研究建立的免疫印迹法(即Western Blot)检测干燥综合征(SS)、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)患者和正常对照血清中的抗胆碱能M3型受体抗体，以评价该抗体在各种疾病中的分布。
首先将抗胆碱能M3型受体进行蛋白SDS-PAGE，然后将其转移到硝酸纤维膜上，经脱脂牛奶封闭过夜。将其与待测血清一起进行温育，如果血清中存在抗胆碱能M3型受体抗体，该抗体就会与硝酸纤维膜上的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。将未结合的抗体及其它成分冲洗干净后，与加入生物素标记的山羊抗人IgG一起孵育，洗去未结合的成分后，加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素一起温育，再次洗去未结合的成分，加入二氨基联苯胺(DAB)显色，若血清中含有抗胆碱能M3型受体抗体，则会在硝酸纤维膜的特定位置显示出颜色，且抗体滴度越高颜色越深。检测原理示意图见图1。
本研究共检测80例SS、80例其他风湿性疾病患者及40例正常人血清中的抗胆碱能M3型受体抗体。检测结果在硝酸纤维膜膜的特定位置出现肉眼可见的棕色条带的为阳性(图4)。
本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明抗胆碱能M3型受体抗体在干燥综合征患者诊断中的意义1.抗胆碱能M3型受体抗体阳性率在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人的比较。
本研究用免疫印迹法检测了抗胆碱能M3型受体抗体在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人的阳性率(表1，图5)。结果显示，抗胆碱能M3型受体抗体在干燥综合征的阳性率显著高于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和正常人。
表1.抗胆碱能M3型受体抗体在不同风湿性疾病的阳性率
*SS患者的抗胆碱能M3型受体抗体与其他风湿性疾病及正常对照组阳性率比较P均＜0.012.抗胆碱能M3型受体抗体与其它干燥综合征特异性抗体的敏感性和特异性比较。
在80例SS患者中对各种抗体的比较可以看出，抗胆碱能M3型受体抗体的敏感性高于抗SSA、SSB及抗α-胞衬蛋白抗体，具有显著的差异(p＜0.01)，而对诊断SS特异性，抗胆碱能M3型受体抗体与抗SSA、SSB比较，差异有显著性(P＜0.01；P＜0.05)；虽然抗胆碱能M3型受体抗体的特异性高于抗α-胞衬蛋白抗体，但差异无统计学意义(P＞0.05)(表2、图6)。
表2 SS患者血清抗胆碱能M3型受体抗体与其他自身抗体的敏感性和特异性比较
注*抗胆碱能M3型受体抗体的敏感性和特异性均明显高于其他抗体，P＜0.01；3.抗胆碱能M3型受体抗体对血清阴性SS患者的意义抗SSA、抗SSB及α-胞衬蛋白抗体是目前干燥综合征较为特异的实验室指标，本研究发现在抗SSA、抗SSB及α-胞衬蛋白抗体阴性的SS患者血清中可以检测到抗胆碱能M3型受体抗体，在抗SSA、抗SSB、α-胞衬蛋白抗体阴性的SS患者血清中抗胆碱能M3型受体抗体阳性率分别为80.0％、82.5％及81.2％，说明抗胆碱能M3型受体抗体的检测对于抗SSA、抗SSB及α-胞衬蛋白抗体阴性的SS患者的诊断具有重要意义(见表3、图7)。
表3.抗胆碱能M3型受体抗体在其他抗体阴性的SS患者的阳性率
4.抗胆碱能M3型受体抗体对其他抗体阳性SS患者的意义本研究结果显示抗胆碱能M3型受体抗体在抗SSA、抗SSB及α-胞衬蛋白抗体阳性的SS患者血清中的阳性率分别为87.5％、88.2％及85.4％，说明该抗体与临床上用于检测SS的抗SSA、抗SSB及α-胞衬蛋白抗体具有很好的一致性，可能是一种新的诊断SS的抗体(表4、图8)。
表4.抗胆碱能M3型受体抗体在其他抗体阳性的SS患者的阳性率
4、抗胆碱能M3型受体抗体与80例SS住院患者临床症状和实验室指标的关系本研究结果显示，抗胆碱能M3型受体抗体阳性患者的口干、眼干、脏器受累的发生率低于抗胆碱能M3型受体抗体阴性组，无统计学意义(P＞0.05)。抗胆碱能M3型受体抗体阳性组ANA、RF的阳性率和IgG、IgA及ESR升高的发生率高于抗胆碱能M3型受体抗体阴性组，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。此外，抗胆碱能M3型受体抗体阳性组的67例SS患者与该抗体阴性组的13例SS患者在年龄及病程上比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
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序列表<110>北京大学人民医院<120>抗胆碱能M3型受体抗体测定在干燥综合征诊断中的应用<140>2005100830770<141>2005-10-8<160>1<170>PatentIn Ver.3.2<210>1<211>1773<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atgaccttgc acaataacag tacaacctcg cctttgtttc caaacatcag ctcctcctgg 60atacacagcc cctccgatgc agggctgccc ccgggaaccg tcactcattt cggcagctac120aatgtttctc gagcagctgg caatttctcc tctccagacg gtaccaccga tgaccctctg180ggaggtcata ccgtctggca agtggtcttc atcgctttct taacgggcat cctggccttg240gtgaccatca tcggcaacat cctggtaatt gtgtcattta aggtcaacaa gcagctgaag300acggtcaaca actacttcct cttaagcctg gcctgtgccg atctgattat cggggtcatt360tcaatgaatc tgtttacgac ctacatcatc atgaatcgat gggccttagg gaacttggcc420tgtgacctct ggcttgccat tgactacgta gccagcaatg cctctgttat gaatcttctg480gtcatcagct ttgacagata cttttccatc acgaggccgc tcacgtaccg agccaaacga540acaacaaaga gagccggtgt gatgatcggt ctggcttggg tcatctcctt tgtcctttgg600gctcctgcca tcttgttctg gcaatacttt gttggaaaga gaactgtgcc tccgggagag660tgcttcattc agttcctcag tgagcccacc attacttttg gcacagccat cgctgctttt720tatatgcctg tcaccattat gactatttta tactggagga tctataagga aactgaaaag780cgtaccaaag agcttgctgg cctgcaagcc tctgggacag aggcagagac agaaaacttt840gtccacccca cgggcagttc tcgaagctgc agcagttacg aacttcaaca gcaaagcatg900aaacgctcca acaggaggaa gtatggccgc tgccacttct ggttcacaac caagagctgg960aaacccagct ccgagcagat ggaccaagac cacagcagca gtgacagttg gaacaacaat1020gatgctgctg cctccctgga gaactccgcc tcctccgacg aggaggacat tggctccgag1080acgagagcca tctactccat cgtgctcaag cttccgggtc acagcaccat cctcaactcc1140accaagttac cctcatcgga caacctgcag gtgcctgagg aggagctggg gatggtggac1200ttggagagga aagccgacaa gctgcaggcc cagaagagcg tggacgatgg aggcagtttt1260ccaaaaagct tctccaagct tcccatccag ctagagtcag ccgtggacac agctaagact1320tctgacgtca actcctcagt gggtaagagc acggccactc tacctctgtc cttcaaggaa1380gccactctgg ccaagaggtt tgctctgaag accagaagtc agatcactaa gcggaaaagg1440atgtccctgg tcaaggagaa gaaagcggcc cagaccctca gtgcgatctt gcttgccttc1500atcatcactt ggaccccata caacatcatg gttctggtga acaccttttg tgacagctgc1560atacccaaaa ccttttggaa tctgggctac tggctgtgct acatcaacag caccgtgaac1620cccgtgtgct atgctctgtg caacaaaaca ttcagaacca ctttcaagat gctgctgctg1680tgccagtgtg acaaaaaaaa gaggcgcaag cagcagtacc agcagagaca gtcggtcatt1740tttcacaagc gcgcacccga gcaggccttg tag 177权利要求
1.具有胆碱能M3型受体的氨基酸、多肽类似物及蛋白。
2.含权利要求1的胆碱能M3型受体或其类似物的诊断试剂盒。
3.含权利要求1的胆碱能M3型受体或其类似物用于免疫印迹法(或使用其它膜条，如硝酸纤维膜或醋酸纤维膜等作为介质来包被抗原的印迹法)、斑点法、ELISA法和金标法检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种胆碱能M3型受体及其类似物用于干燥综合征的检测。这种蛋白可特异性的结合干燥综合征患者体内的特异性抗体，具有很高的敏感性和特异性。
文档编号G01N33/53GK1896101SQ20051008307
公开日2007年1月17日 申请日期2005年7月14日 优先权日2005年7月14日
发明者栗占国 申请人:北京大学人民医院