一种检测吡虫啉的胶体金试纸条及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测吡虫啉的胶体金试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测吡 虫啉的胶体金试纸条，其特别适用于烟草中吡虫啉残留的检测。
【背景技术】
[0002] 吡虫啉（頂1 )，1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺，属于新型烟碱类杀 虫剂。頂I是昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)抑制剂，通过阻止頂I刺激AchR引起的昆虫神 经信号传导而发挥杀虫作用，其兼具触杀、驱避、胃毒等多重杀虫活性和高效、低毒、广谱、 内吸、残效期长等特点。近年来，吡虫啉已经广泛应用于水稻、棉花、茶树、大豆、烟草等作物 来防治飞虱、介壳虫、白粉虱等农业害虫，而对烟草生产过程中的蚜虫、叶蝉等刺吸式口器 害虫有特效。目前含頂1的农药产品已在120多个国家的140余种农作物上登记使用，在世界 范围内吡虫啉的使用量已居所有杀虫剂的首位。该农药会对人类和哺乳动物产生慢性毒理 效应，0.05mg/kg的吡虫啉就会损害人体淋巴细胞的遗传物质DNA。
[0003] 目前国内外已制订出多种农产品中頂1的最大残留限量标准(1此8)。2008年欧盟 重新审理和修正了頂I在近400中农产品中的MRLs，其中大部分谷物、水果、蔬菜中的MRL均 在0.05mg/kg。而随着烟草和烟草制品的国际贸易日趋增加，一些发达国家已经制定了烟草 及烟草制品中农药残留量的最大限量法规，如美国农业部1987年就制定了对进口烟草农药 残留的限量指标，包括19种农药，世界上其它一些国家对多种农药在烟草(烟草制品）中的 最大残留量制定了标准。综合德国、美国、西班牙和意大利制定的国家标准，对卷烟和烟叶 中农药残留最高限量做出规定的就多达151种农药。为了提高烟草安全性，烟草科学研究合 作中心制定了严格的农药最高残留限量标准，这是我国烟草贸易必须面对的技术壁皇。
[0004] 吡虫啉是极性化合物，具热不稳定性的特点，检测吡虫啉残留量常规方法有气相 色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GC-MS)、免疫分析法(ELISA)等方法。然 而采用这些检测方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员，样品前处理过程复杂且花费高、 费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适于烟 草中吡虫啉残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国 烟草公司、烟草监管部门等开展检测工作。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够检测烟草中吡虫啉残留量的胶体金试纸条，并且 提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。
[0006] 本发明所提供的检测吡虫啉的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反 应膜、吸水垫和底板;所述反应膜上具有包被有吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和 包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫喷涂有吡虫啉单克隆抗体-胶体金标记 物。
[0007] 所述吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物是由吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联得到，所 述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。
[0008] 所述吡虫啉半抗原是以2-氯-5-甲基吡啶-3-甲醛为起始原料，经过溴代反应，得 到中间体2-氯-5-甲基溴代吡啶-3-甲醛产物，而后与2-硝基亚氨基咪唑烷进行亲核取代反 应，得到醛基化的吡虫啉产物，最后与氨基乙酸缩合，获得带有四碳链长度间隔臂的羧基吡 虫啉半抗原产物，其分子结构式为：
[0009]
〇
[0010]所述吡虫啉单克隆抗体是以吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获 得;所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。
[0011] 所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物 释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0012] 所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料;所述样品吸收垫可为吸滤纸或 滤油纸;所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料;所述吸水垫为吸水纸;所述反应膜可为 硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
[0014] 1)制备喷涂有吡虫啉单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0015] 2)制备具有包被有吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗 体的质控线的反应膜；
[0016] 3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成 试纸条。
[0017]具体地说，步骤包括：
[0018] 1)半抗原制备：以2-氯-5-甲基吡啶-3-甲醛为起始原料，经过溴代反应，得到中间 体2-氯-5-甲基溴代吡啶-3-甲醛产物，而后与2-硝基亚氨基咪唑烷进行亲核取代反应，得 到醛基化的吡虫啉产物，最后与氨基乙酸缩合，获得带有四碳链长度间隔臂的羧基吡虫啉 半抗原产物；
[0019] 2)将吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联，得到吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物；
[0020] 3)用吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过 融合、筛选，得到吡虫啉单克隆杂交瘤细胞株；
[0021 ] 4)提取小鼠 IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0022] 5)分别将吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线 (T)和质控线(C)上；
[0023] 6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0024] 7)将制备的吡虫啉单克隆抗体加入制备的胶体金中，得到吡虫啉单克隆抗体-胶 体金标记物；
[0025] 8)将吡虫啉单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37°C烘lh后取出， 置于干燥环境中保存备用；
[0026] 9)将样品吸收垫用含0.5 %牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0. lmo 1/L磷酸盐 缓冲液浸泡2h，37 °C下烘干2h;
[0027] 10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释 放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3_宽的小条，加塑料盒，真空包装，4 ~30°C条件下可保存12个月。
[0028] 本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测烟草中吡虫啉残留的方法， 它包括如下步骤：
[0029] (1)样品前处理；
[0030] (2)用试纸条进行检测；
[0031] (3)分析检测结果。
[0032]本发明的吡虫啉快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分 析技术，将啦虫啉单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的P比虫啉在流 动过程中，与结合物释放垫上的啦虫啉单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶 体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合 吡虫啉单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含 有P比虫琳残留。
[0033] 检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当吡虫啉在样品中的浓度低于检测限 或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的吡虫啉半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)内各出现一条红色条带，且T线显色比C线 显色深或与C线显色一致;如果吡虫啉在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶 体金标记物会与吡虫啉全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与吡虫啉半抗原-载体蛋 白偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图2所示。
[0034] 阴性：当质控线（C)显示出红色条带，检测线（T)同时也显示出红色条带，且(T)线 颜色接近或深于(C)线时，判为阴性。
[0035]阳性：当质控线（C)显示出红色条带，而检测线（T)不显色或（T)线颜色浅于(C)线 时，判为阳性。
[0036] 无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该 试纸条均判为无效。
[00