一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法。
(二)
【背景技术】
[0002]粪便隐血是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜下均不能证实的出血。粪便隐血检测是粪便常规检验项目之一，对于消化道出血及消化道肿瘤的诊断和鉴别诊断有重要的参考价值，常作为诊断消化道出血的筛选指标。
[0003]粪便隐血检测通常有化学法和免疫法两种。以愈创木酯、联苯胺、邻甲苯胺、还原酚酞、四甲基联苯胺等色原性物质为主体的化学检测方法，其中以邻甲苯胺化学法使用最多。化学法虽然费用低廉、反应快速、结果容易判断，但是易受多种因素干扰、易出现假阳性。基于特异性抗原抗体反应的免疫学方法，如乳胶免疫化学凝集法、ELISA法、免疫层析法等逐渐在临床广泛使用，其中免疫层析法被世界卫生组织和世界胃镜检查协会推荐用于粪便隐血检测。
[0004]目前研究较多方法即为便隐血试剂双联检测法，是特异性检测人粪便中的血红蛋白(Hb)和转铁蛋白(Tf)的检测方法。由于转铁蛋白在肠道内的稳定性及抗菌能力都高于血红蛋白，克服了血红蛋白易被胃酸、细菌降解消化的缺点，提高了在上消化道失血检测的阳性率。同时，由于在血液中Hb和Tf的比值为51.2/1，而粪便中Hb和Tf的比值为5.4/1，因此转铁蛋白法的敏感性高于血红蛋白胶体金检测法。而在遗传性无转铁蛋白血症，各种恶性疾病，炎症为主的多种疾病(如手术、创伤、心肌梗死、感染等)均可导致转铁蛋白值低下的情况中，Hb检测能弥补Tf检测的不足。所以，联合检测Hb和Tf法，灵敏度高、特异性强，对检测消化道出血的临床意义可起到优势互补的作用。
[0005]万华普曼公司率先研发出TF/Hb双联胶体金诊断试纸检测粪便隐血的新方法，将抗人TF抗体和抗人Hb抗体整合在同一试纸带上(两张试纸条拼接在一起，有两个加样口)，可同步检测TF与Hb，互不干扰，二者优势互补，但其Hb检出限有限(经测试，20yg/ml能检出，lyg/ml不能检出)，灵敏度和检出限有待进一步提高。
(三)
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种灵敏度高和检出限高、只需一次加样的检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]—种检测便隐血的胶体金双联试纸条，由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸组成，其特征在于:所述样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸按层析方向顺次搭接粘贴在底衬上；
[0009]所述标记垫上包含有胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl和鼠抗人Tf单克隆抗体Tfl，鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl浓度为5?20yg/mL，鼠抗人Tf单克隆抗体Tf 1浓度为5?20μg/mL；
[0010]所述包被膜上依次设置有检测线一、检测线二和质控线，检测线一和检测线二包被有与标记垫中的抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2，质控线包被有鼠抗IgG;检测线一包被的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2的浓度为0.5?2mg/mL，用量按膜包被液量为30μ1/27?35cm(采用专门的包膜机进行喷涂，设置速度为30μ1/27?35cm，以Ιμ?/cm为宜)；所述检测线二包被的鼠抗人Tf单克隆抗体Hb2的浓度为0.5?2mg/mL，用量按膜包被液量为30μ1/27?35cm;所述质控线包被的羊抗鼠IgG浓度为0.5?2mg/mL，用量按膜包被液量为30μ1/27?35cm。
[0011]所述胶体金颗粒的紫外扫描最大吸收波长为500?550nm(500?550nm吸收峰值
3.0Abs，450nm是2.lAbs，600nm是 1.5Abs)。
[0012]检测线一、检测线二和质控线间隔距离为3?5mm。
[0013]—种制备所述胶体金双联试纸条的方法，所述方法包括:
[0014](1)制备0.01 %?0.04%的胶体金颗粒溶液，将鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl和鼠抗人T f单克隆抗体T f 1分别进行标记，待充分混匀后，加入1 % B S A，封闭5?15分钟后，以12000印111离心5?15分钟，弃上清，沉淀用20?10011^[、卩!17.5?8.5磷酸盐缓冲液溶解(至原胶体金溶液体积的10% )，放置于2?8°C条件下备用；用含1 %BSA、2%蔗糖的20?100mM、pH7.5?8.5磷酸盐缓冲液将两种胶体金溶液按2?10倍进行稀释后混合，将稀释后的溶液按40?60yL/cm2玻璃纤维均匀涂垫，37°C真空干燥0.5?1.5小时，裁剪宽度为5?10mm，得到标记垫;所述胶体金溶液中每lml胶体金加入0?20μ1 K2CO3，选择能够保持颜色不变的最低的pH值，一般选择lml胶体金加入10μ1 K2CO。所述胶体金溶液中每lml胶体金结合8?20μg的单克隆抗体，选择能够保持颜色不变的最小的蛋白量，一般为lml胶体金结合15yg的蛋白。
[0015](2)分别将与步骤(1)中抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf 2用包被缓冲液调节至浓度为0.5?2mg/mL，将羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节至浓度为0.5?2mg/mL，将鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2分别喷到包被膜上检测线一和检测线二处，将羊抗鼠IgG喷到包被膜上的质控线处;所述鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2、鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2和羊抗鼠IgG的用量按包膜包被液量均为30μ1/27?35cm;质控线以及两条检测线间隔3?5mm，在湿度〈30%，温度30?40°C烘箱中瞭干8?12小时，封袋，备用；
[0016](3)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。
[0017]所述样品垫为经过20?100mM、pH7.5?8.5的Tris-HCl缓冲液处理过的玻璃纤维棉材质，标记垫为玻璃纤维棉材质，包被膜为硝酸纤维素材质，底衬为PVP胶板材质。
[0018]本发明检测便隐血的胶体金双联试纸条的检测原理是双抗体夹心法，检测人粪便样本中微量血红蛋白(Hb)和转铁蛋白(Tf)。含血红蛋白抗原和/或转铁蛋白抗原的粪便样本稀释液层析至胶体金结合垫，与胶体金标记的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hbl和/或鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tfl形成胶体金抗体-抗原复合物，层析至检测区，分别与预包被的另一鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2(检测线T1)和/或鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2(检测线T2)，在检测区形成双抗体夹心复合物，呈现红色沉淀线;余下的未结合胶体金层析至质控线(C)与预包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体结合呈现红色的沉淀线。若样本中不含血红蛋白抗原和/或转铁蛋白抗原，则检测区没有其对应的红色沉淀线。无论样本中是否存在血红蛋白抗原和/或转铁蛋白抗原，质控线(C)都会出现一条红色沉淀线。
[0019]本发明对粪便中血红蛋白和转铁蛋白进行同步检测，特异性强，灵敏度高(Hb检出限为200ng/ml，Tf检出限均为40ng/ml)，对消化道出血性疾病的阳性检出率有显著提高，能准确检测无症状、少量、持续，肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血等药物干扰。
(四)
【附图说明】
[0020]图1为本发明的检测便隐血的胶体金双联试纸条的结构示意图；
[0021]其中:1、样品垫;2、标记垫;3、包被膜;4、吸水纸;5、检测线;6、质控线;7、底衬。
[0022]图2为本发明产品与现有双联检测试剂检测结果对照;其中A为Hb200ng/mL，B为Hb400ng/mL，C为Hb lyg/mL，D为Hb 20yg/mL，E为If 40ng/mL，F为If 200ng/mL，G为If 400ng/mL，F为If 40yg/mL;各图左侧条为本发明产品，右侧条为市购现有产品；
[0023]图3为本发明产品配套的塑料外壳。
(五)
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0025]实施例1:
[0026]采用双抗体夹心法免疫层析原理，检测人粪便中微量血红蛋白和转铁蛋白。
[0027]如图1所示，在该