水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及胶体金检测试纸条技术领域，具体设及一种水貂阿留申病毒抗体胶体 金检测试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水貂阿留申病（AleutianDisease,AD)是由水貂阿留申病毒（AleutianMink DiseaseVirus,AMDV)引起的一种免疫系统素乱、代谢异常的慢性传染病。水貂阿留申病 可W严重影响水貂的毛皮质量，损害其生育能力，降低存活率，给养貂业带来巨大的经济损 失，被称为毛皮动物=大疫病之一，目前国内外主要通过检测淘汰来防控该水貂阿留申病。
[0003] 目前，常规的AD检测技术主要是采用对流免疫电泳（CIE巧，但该方法检测步骤繁 琐、耗时，需要专业人员进行操作且主要依赖实验室，运些弊端严重阻碍了水貂阿留申病检 测的普及和推广。因此，研究一种简单、快捷的AD检测方法具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有的AD检测技术存在的检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作 且检测主要依赖实验室的问题，本发明提供一种水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及 其制备方法。
[0005] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006] 本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，包括PVC底板，依次粘帖在PVC 底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；所述金标结 合垫包被有水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物W及小鼠IgG与胶体金的偶 联标记物，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，所述硝 酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0007] 本发明还提供了上述水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法，该方法 包括W下步骤：
[0008] 步骤一、水貂阿留申病毒细胞抗原的制备：将水貂阿留申病毒接种长满单层的 CRFK细胞，待CRFK细胞有85 %~90 %病变时，收获细胞培养液，反复冻融3次后，采用差速 离屯、和不连续薦糖密度梯度离屯、纯化病毒，获得纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原；
[0009] 步骤二、水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确 定纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为33ug~36ug: 1ml，按照此 用量比例逐滴加入纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，再加入终浓度为1 %的牛血清白蛋白， 揽拌后获得水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物，采用低溫超速离屯、法对该偶 联标记物进行纯化；
[0010] 步骤=、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体 金溶液的用量比例为3. 85ug~4.化g:lml，按照此用量比例逐滴加入小鼠IgG，再加入终浓 度为1 %的牛血清白蛋白，揽拌后获得小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，采用低溫超速离屯、 法对该偶联标记物进行纯化；
[0011] 步骤四、试纸条的组装：采用喷金仪将水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联 标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜上，室溫条件下自然干燥， 密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原、羊抗鼠IgG分别划 膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜 依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，室 溫保存。
[0012] 进一步的，步骤一中，将水貂阿留申病毒细胞接种长满单层的CWK细胞后，于 37°C解育1小时，加入含5 %血清的细胞培养液，37°C静置培养并逐天观察CRFK细胞病变情 况。
[0013] 进一步的，所述胶体金溶液采用巧樣酸=钢还原法制备：取1 %氯金酸溶液1ml， 加入99ml的超纯水配置成终浓度为0. 01 %的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1 %巧樣酸 =钢1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分 钟，室溫冷却，获得胶体金溶液，4°C保存备用，胶体金颗粒直径为40nm。
[0014] 进一步的，步骤二中，所述逐级稀释法确定水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶 液的用量比例的具体过程如下：用0.Imol/L的碳酸钟溶液调节胶体金溶液的PH值为8. 4， 向11支离屯、管中分别加入1ml胶体金溶液；将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原逐级稀释后 即含量分别为加g、lOug、1加g、20ug、2加g、30ug、3加g、40ug、4加g、50ug，按照上述顺序加入 至IJ2号管至11号管中，并与离屯、管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分 别加入10%的氯化钢溶液1ml混匀，室溫静置2小时W上观察结果，1号管为空白对照； [001引 2号管至6号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，7号管至11号管中，保持胶体金的 红色不变；因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒细胞抗原加入量最低的离屯、管即7号 管中的水貂阿留申病毒细胞抗原含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该 最低稳定量的基础上再加上10%~20%即为稳定1ml胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒 细胞抗原的实际使用量，即水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为：33ug~ 36ug:1ml。
[0016] 进一步的，步骤=中，逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例的具体 过程如下：向11支离屯、管中分别加入1ml胶体金溶液；将小鼠IgG逐级稀释后即含量分别 为0.加g、lug、1.加g、化g、2.加g、3ug、3.加g、4ug、4.加g、加g，按照上述顺序加入到2号管 至11号管中，并与离屯、管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入 10%的氯化钢溶液1ml混匀，室溫静置2小时W上观察结果，1号管为空白对照；
[0017] 2号管至7号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，8号管至11号管中，保持胶体金的 红色不变；因此，胶体金红色不变且小鼠IgG加入量最低的离屯、管即8号管中的小鼠IgG含 量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10%~ 20%即为稳定1ml胶体金溶液所需的小鼠IgG的实际使用量，即小鼠IgG与胶体金溶液的 用量比例为：3. 85ug~4.化g: 1ml。
[0018] 进一步的，步骤二中，采用低溫超速离屯、法对该偶联标记物进行纯化的具体过程 如下：首先将体积为V的金标水貂阿留申病毒细胞抗原在4°C下W3000rpm/min离屯、40分 钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4°C下Wl〇〇(K)rpm/min离屯、40分钟，弃去上清，用 0.Olmol/L、抑7. 4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V，稳定后过夜：4°C下，再W10000巧m/min离屯、40分钟，弃上清，用0.Olmol/L、抑7. 4的PBS 缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V的1/10,获得纯化的金 标水貂阿留申病毒细胞抗原，4°C保存备用；所述PBS缓冲液中含有1%BSA和0. 02%叠氮 钢。
[0019] 进一步的，步骤=中，采用低溫超速离屯、法对该偶联标记物进行纯化的具体过程 如下：首先