一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法
【专利说明】-种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法
[0001] 一、技术领域： 本发明设及伪结核棒状杆菌的检测技术领域，具体设及一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。
[000引二、【背景技术】： 山羊干酪性淋己结炎（CaseousLymphadenitis,CLA)(又称山羊伪结核）是由伪结核 棒状杆菌（仿巧weAac妃化/otoAerci/iosis，CjO)引起的W淋己结肿大为主要特征 的一种慢性人兽共患病，主要感染山羊和绵羊，分为体表型和内脏型两种。患病畜及隐性感 染动物可通过鼻分泌物、排泄物W及破溃的脈肿流出的浓汁向外界排放大量的病原体，病 原体通过直接或间接接触感染健康羊只并造成±壤、水、食物、牧草地的污染。患病羊产奶 量下降、产毛量减少、繁殖能力减弱，在食欲不明显减退的情况下逐渐消瘦，生产力下降的 同时能源消耗不减，不仅增加了养殖成本，还引发羊肉、羊奶鲜乳等动物性食品病原微生物 及兽药残留严重超标，带来食品安全隐患。临床上对体表型脈包病羊通常可W采取治疗或 淘汰措施，但内脏型患病羊只无明显临床症状，较难及时发现采取相应措施。因此，内脏型 患病羊只的有效诊断对于该病的防控十分重要。
[0003] 目前，对于该病的病原学诊断方法有病原菌的分离培养与生化鉴定、协同溶血试 验、PCR，但运些方法基本不适用于内脏型患羊的活体诊断。鉴于国内目前尚无伪结核疫苗， 而患病羊血清中必然存在抗伪结核棒状杆菌抗体，因此，ELISA检测方法检测其抗体水平可 有效反映羊只的感染情况。
[0004] 目前，间接化ISA方法检测山羊伪结核抗体所用的包被抗原包括原核表达PLD蛋 白、超声裂解的菌体蛋白。W原核表达的PLD蛋白做包被抗原时，特尔异性较差，会与其他 疫病阳性血清发生交叉反应。W超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得 结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测 结果。本发明W完整山羊伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，检测结果特异性强，且重复性 好，避免了上述两种包被抗原造成的缺陷。
[000引 S、
【发明内容】
： 本发明为了解决上述【背景技术】中的不足之处，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，该方法操作简单，检测结果灵敏稳定，适用于大批量样本检测。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种山羊伪结核杆菌抗体的化ISA 检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包 被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接 ELISA检测试剂盒。
[0007] 包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mLLB培养液中，在200~ 220巧m，37°C的条件下扩大培养4化后，10000~12000巧m离屯、3~5min，收集菌体，用PBS 洗涂菌体=次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原。
[000引配制不同浓度的包被抗原，确定包被抗原浓度对应的ODe。。值在0. 060~0. 090之 间。 界定了待检血清的临界值。
[0009]与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明W完整的伪结核棒状杆 菌菌体作为包被抗原，建立间接化ISA检测方法，检测病羊血清中是否含有抗伪结核棒状 杆菌的抗体，依此判断病羊是否感染伪结核，该诊断方法能够针对性的检测抗羊伪结核抗 体，为伪结核防控提供有力监测手段。
[0010] 四、【具体实施方式】： 本发明设及的羊伪结核抗体检测试剂盒的制备方法，包括W下步骤： 1.间接化ISA检测方法的建立 步骤一、包被抗原的制备 将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mLLB培养液中，在200~220rpm，37°C的条件下扩 大培养4化后，10000~1200化pm离屯、3~5min，收集菌体。用PBS洗涂菌体S次，用碳酸 盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液。此即为包被抗原。
[0011] 步骤二、酶标板的包被 在分光光度计上调整伪结核棒状杆菌菌悬液的浓度使其ODe。。在0. 060~0. 090范 围，取菌悬液100yL/孔加至酶标板，置于4°C过夜。包被结束后，将PBST添加至酶标板， 200yL/孔，轻微震荡10s后，弃掉酶标板中的PBST，重复洗涂3次，最后一次洗涂结束后于 干净纱布拍干孔中残留PBST。
[001引步骤S、封闭 取5% (百分比）脱脂奶粉，100yL/孔添加至酶标板，37°C封闭1~化。封闭结束后洗 涂，洗涂操作同步骤二。
[0013] 步骤四、一抗血清的解育 将待检血清做1:400 (体积比）稀释后，100yL/孔添加至酶标板中，37°C解育比。解 育结束后，洗涂操作同步骤二。
[0014] 步骤五、酶标二抗的解育 用PBST对酶标二抗做1 : 5000稀释，100yL/孔添加至酶标板中，37°C解育比。解育 结束后，洗涂操作同步骤二。
[001引 步骤六、显色 取4°C避光保存的TMB显色液，100yL/孔添加至酶标板，37°C解育20min。
[0016] 步骤屯、反应终止及结果测定 取室溫保存的2M稀H2SO4,100yL/孔添加至酶标板，于酶标仪450nm读取结果。
[0017]2.包被抗原浓度的确定 将纯化培养的伪结核棒状杆菌的菌体作为包被抗原，CLA的阳性血清为阳性对照，在酶 标板上进行方阵滴定试验。用碳酸盐缓冲液将伪结核棒状杆菌菌体重悬，在酶标仪上调整 其浓度，使其ODe。。分别为0. 1、〇. 08、0. 05、0. 03、0. 01，100yL/孔纵向包被酶标板，各浓度 分别包被一列，置于4°C，包被过夜。按照上述间接化ISA检测方法操作，WP/N值最大确定 抗原的最佳包被浓度，根据试验结果得，当ODe。。为0. 08时所对应的菌液浓度为抗原的最佳 包被浓度。具体检测结果如表1: 表1?抗原包被浓度检测结果
3. 临界值的确定 按照1中ELISA操作步骤，将20份标准阴性血清做1 : 400稀释后作为一抗血清，测 定其〇〇45。，计算器平均值(:|)和标准差（SD)，临界值即为0〇45。和3SD之和，本研究所确定的 临界值为0.329。具体测定结果如表2:
4. 特异性试验 按照1中化ISA操作步骤，分别将羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清做 1:400稀释，测定其0〇45。，同时设置伪结核标准阳性血清、阴性血清做阳性、阴性对照，检测 结果显示羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清的测定结果均小于阳性临界值 0. 329,说明本研究所确定的试验方法特异性良好。具体试验结果如表3 :
5. 重复性试验 (1) 批内重复性试验：在同一块酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血清各5份， 按照1中ELISA操作步骤，测定0〇45。，每份血清做S个重复，计算批内变异系数（CV)，批内 CV= (SD/OD45。平均值）X100%。结果显示，批内变异系数均小于5%。具体试验结果如表4:
(2) 批间重复性试验：在不同批次包被的酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血 清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定0〇45。，每份血清做=个重复，计算批间变异系数 (CV)，批间CV= (SD/0D45d)X100%。结果显示，批间变异系数均小于10%。具体试验结果如 表5 :
6.ELISA试剂盒的组装 伪结核间接化ISA检测试剂盒具体组成如下： (1) 空白96孔酶标板一块； (2) 伪结核棒状杆菌纯品一支，置于-20°C保存，使用前，用包被稀释液调整ODe。。值至 0. 08 ; (3) CLA阳性血清，CLA阴性血清各一支； (4) 辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体，使用前，用样品稀释液1:5000稀释； (5) TMB显色液，终止液，封闭液，样品稀释液，洗涂液各一支。 具体实施例
[0018] 从羊场采集临床症状的山羊血12份，其中4份具有典型的山羊脈胞症状，4份为表 观正常内脏型的患病羊只，4份为健康羊只。分离血清，测定其0〇45。。检测结果显示体表型、 内脏型患病羊只的〇〇45。均大于阳性临界值，健康羊只的0D45。均小于阳性临界值，与实际患 病状况一致，说明本研究建立检测方法可靠。具体检测结果如表6 :
【主权项】
1. 一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制 备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并 界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒。2. 根据权利要求1中所述一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法， 其特征在于：包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mLLB培养液中，在200~ 220rpm，37°C的条件下扩大培养48h后，10000~12000rpm离心3~5min，收集菌体，用PBS 洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原。3. 根据权利要求2中所述的一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方 法，其特征在于：配制不同浓度的包被抗原，确定包被抗原浓度对应的OD6。。值在0. 060~ 0. 090之间。4. 根据权利要求1中所述的一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方 法，其特征在于：界定了待检血清的临界值。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。本发明以完整的伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，检测血清中是否含有抗伪结核棒状杆菌抗体，判断山羊是否感染伪结核。本发明确定了阴阳性临界值，具有很高的特异性和重复性，能够快速有效的检测出山羊血清中的伪结核抗体，可用于山羊伪结核诊断、流行病学调查。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105181963
【申请号】CN201510458766
【发明人】陈德坤, 霍宁宁, 刘鹤媛, 周铭
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月30日